川椒方治疗小鼠变应性结膜炎的实验研究

李素毅 高健生 接传红 宋剑涛 严 京

(中国中医科学院眼科医院，北京市石景山区鲁谷路33号，100040)

变应性结膜炎(Allergic Conjunctivitis，AC)是最常见的眼表疾病之一，属于中医的“目痒”“痒如虫行症”“时复证”范畴，病情复杂难治。川椒方为高健生主任医师的经验方，临床上取得了良好的疗效。本研究通过建立小鼠变应性结膜炎的动物模型，选择症状学、细胞学和血清免疫学中的较为重要的指标，验证川椒方对变应性结膜炎的治疗作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级Balb/c雌性小鼠，6～8周，体重18～20g。(中国医学科学院动物实验中心提供。动物合格证号:SCXK京2009-0007)。

1.2 主要试剂 OVA(美国 Sigma公司，A5503)，Al(OH)3(美国Sigma公司，A4682)，ELISA 试剂盒(美国R＆D公司，CK-E90529M)，川椒方水提液(中药材购自北京燕北药材公司，知母、地肤子、牛蒡子、川芎、川椒、防风等煎煮后取煎液蒸发浓缩)，盐酸奥罗他定滴眼液(爱尔康公司)。

1.3 主要仪器 高速冷冻离心机(日本久保田3740)，病理包埋机(北京海鹰达科技发展公司BMG-011)，病理切片机(德国LEIC-RM2235)，正置式显微镜+图像分析系统(日本OLYMPUS-BX51)，全自动酶标仪(Rayto公司，RT-6000)。

2 方法

2.1 动物模型制备及实验流程 参照Nakamura的AC小鼠模型方法［1］，balb/c小鼠进入动物房适应1周后开始实验。1)致敏阶段:于实验第0天、7天、14天分别给予腹腔注射含OVA100μg与佐剂Al(OH)35mg共200μL的混合物使小鼠致敏。2)局部加强致敏:第15天至21天，每天每眼用OVA400μg溶于生理盐水中点眼以加强致敏。3)激发:第24天将OVA(每眼400μg)溶于pH7.2的PBS液中滴入双眼进行致敏原攻击，以诱导AC症状。4)治疗:第25天开始至31天治疗7天。5)再次激发:7天治疗结束后，再次OVA点眼局部激发，激发后20min观察记录AC超敏反应情况，24h后摘眼球法采血，处死动物，取结膜行HE、甲苯胺兰染色，观察切片变化并计数嗜酸性粒细胞数量;取血清，ELISA法检测免疫球蛋白IgE、IgG1及免疫因子IL-4。

2.2 分组及处理 随机分为6组，每组10只。1)空白组为非模型正常小鼠，生理盐水灌胃;2)模型组为AC模型小鼠，生理盐水灌胃;3)阳性药物对照组:AC模型小鼠，盐酸奥罗他定滴眼液点眼;4)、5)、6)组用AC模型小鼠，分别以5倍、10倍、20倍川椒方水提液灌胃。

2.3 体征评分标准 于点眼激发20min后裂隙灯显微镜观察眼部体征。采取盲法由临床眼科医师分别对结膜水肿、结膜充血、眼睑浮肿、分泌物产生4项指标的不同程度进行评分(0～3分)。最后将4项指标各自的分值相加得出总分，最低0分，最高12分。评分标准参照 Magone［2］、吕秋军［3］、徐岩等［4］标准，改良后具体见表1。

表1 改良后体征评分标准

2.4 细胞计数方法 再次激发24h后放血处死小鼠并立即取材。眼球及眼睑一同取出后10%中性甲醛溶液固定，制蜡块，4μm连续切片，苏木素 -伊红(HE)、甲苯胺兰染色，显微镜下计数嗜酸性粒细胞、观察肥大细胞。

2.5 免疫血清制备 用摘眼球法采血，4℃恒温离心，3000r/min，15min，-20℃冰箱中低温保存。

2.6 统计学方法 采用SAS 8.02软件进行统计，所有结果用均数±标准差(±s)来表示。多组间的比较采用完全随机设计的方差分析。2组间的比较，采用t检验;所有统计检验均采用双侧检验。结果以P＜0.05为有统计学意义。

表2 裂隙灯下小鼠眼部体征评分(±s，n=10)

表2 裂隙灯下小鼠眼部体征评分(±s，n=10)

注:模型组与正常组相比，＊＊P＜0.01;川椒方各浓度组与模型组相比，△△P＜0.01;川椒方高浓度组与阳性药物组相比，※P＞0.05;川椒方中、低浓度组与阳性药物组相比，*P＜0.05。

1.60 ±0.84模型组 10.80 ±1.23＊＊阳性药物组 5.50 ±1.08川椒方低浓度组 7.10 ±1.52△△＊川椒方中浓度组 7.00 ±1.25△△＊川椒方高浓度组 6.00 ±1.05组别 眼部体征积分正常组△△※

3 结果

3.1 AC小鼠模型观察 模型较正常小鼠易激惹或倦怠，易脱毛。裂隙灯下观察见睑裂较小，充血水肿明显，部分严重小鼠内眦部可见瘙痒后的抓痕。明显畏光、流泪，黏液性分泌物增多，严重的浸湿全眼周皮毛。结膜充血呈乌红色，血管迂曲，水肿明显。病理切片显示:结膜组织疏松，充血水肿明显，固有层内嗜酸性粒细胞及中粒细胞浸润，肥大细胞明显增多，脱颗粒现象明显。

3.2 川椒方的治疗作用

3.2.1 临床症状评分 见表2。模型组较正常对照组评分增高，各川椒方组体征评分值较模型组明显降低，均具有统计学意义(P＜0.01);与阳性药物对照组相比，高浓度组无统计学意义(P＞0.05)，低、中浓度有统计学意义(P ＜0.05)。

3.2.2 病理切片观察川椒方对晚期炎症的影响 见表3。1)结膜内嗜酸性粒细胞计数结果显示:模型组小鼠结膜内细胞计数较正常组增高具有统计学意义;各川椒方组结膜内嗜酸性粒细胞数目较模型组明显降低，其中，中浓度组和低浓度组与模型组比较具有统计学意义(P＜0.05)，高浓度组与模型组比较有统计学意义(P＜0.01);与阳性药物对照组相比，高浓度组无统计学意义(P＞0.05)，低、中浓度有统计学意义(P＜0.05)。2)肥大细胞:模型组小鼠结膜内肥大细胞聚集增多脱颗粒明显。治疗后的各组以上特点都明显减轻。其中高浓度组和阳性药物组表象基本一致。

表3 川椒方对小鼠结膜嗜酸性粒细胞的影响(±s，n=10)

表3 川椒方对小鼠结膜嗜酸性粒细胞的影响(±s，n=10)

注:模型组与正常组相比，＊＊P＜0.001;川椒方高浓度组与模型组相比，△P＜0.01;川椒方中、低浓度组与模型组相比，▲P＜0.05;川椒方高浓度组与阳性药物组相比，※P＞0.05;川椒方中、低浓度组与阳性药物组相比，*P ＜0.05。

0.40 ±0.70模型组 24.50 ±5.62＊＊阳性药物组 8.20 ±2.10川椒方低浓度组 13.90 ±2.60▲＊川椒方中浓度组 12.50 ±1.90▲＊川椒方高浓度组 8.60 ±1.51组别 嗜酸性粒细胞计数正常组△※

表4 ELISA检测川椒方对AC小鼠血清指标的影响(±s，n=10)

表4 ELISA检测川椒方对AC小鼠血清指标的影响(±s，n=10)

注:与正常组相比，★P ＜0.01;与模型组相比，▲P ＞0.05;与模型组相比，▲▲P ＜0.01;与模型组相比，●P ＜0.05;与阳性药物组比，※P ＞0.05;与阳性药物相比，△△P ＜0.01。

组别 IgE(μg/mL) IgG1(μg/mL) IL-4(pg/mL)正常组●※3.51 ±0.79 3.54 ±0.97 16.19 ±3.04模型组 7.53±0.84★ 9.13±0.62★ 26.32±5.53★阳性药物组 4.27 ±0.69 4.71 ±0.52 22.88 ±4.02川椒方低浓度组 6.98 ±0.88▲△△ 8.77 ±1.86▲△△ 20.76 ±4.75●※川椒方中浓度组 5.33±1.21▲▲△△ 6.24±1.01▲▲△△ 20.27±3.77●※川椒方高浓度组 5.13 ±0.73▲▲※ 5.59 ±0.68▲▲※ 20.11 ±1.98

3.3 川椒方的作用机理 ELISA检测血清指标显示:1)模型组IgG1、IgE、IL-4升高，具有统计学意义(P＜0.01)。2)与模型组比较，中、高浓度组小鼠血清IgG1、IgE水平降低，具有统计学意义(P＜0.01)，低浓度组无统计学意义(P＞0.05);各浓度组IL-4均降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。3)与阳性药物对照组相比，高浓度组IgG1、IgE无统计学意义(P＞0.05)，疗效相当，中低浓度组比较有统计学意义，疗效差于西药组(P＜0.01);各浓度组IL-4均降低，与阳性药物相比差异无统计学意义。结果见表4。

4 讨论

变应性结膜炎是一种高发的眼表疾病，人群患病率约20%［5］。随着环境变化、污染加重，发病率仍有增长的趋势。局部用药起效快，但作用不持久。长期用药尤其是使用糖皮质激素类药物会带来干眼症［6］、青光眼等严重并发症。

川椒方是汲取《黄帝内经》、金代医家刘完素学术思想“六气发病皆从火化”的学术观点，发挥中医学整体观念的治疗优势，灵活运用中医的辨证法，将温热药物川椒与寒凉药物同用，去性取用，是用于治疗AC的经验方。作为内服中药汤剂，川椒方能有效改善AC急性期各项症状，并能减轻晚期细胞反应带来的损伤。不仅避免了局部用药对眼表微环境的影响和严重的眼部并发症而且对患者常合并的变应性鼻炎、哮喘等其他系统的变应性疾病症状起到改善作用。

AC反应机制复杂，涉及多种免疫机理及免疫因子参与。虽然机制尚不十分清楚，但I型变态反应为主，IV型变态反应参与作为基本机理是无异议的。起到了与西药相当的疗效，并且有其独特的优势，值得推广和进一步研究。

［1］Nakamura，Takao MD.Detailed Criteria for the Assessment of Clinical Symptoms in a New Murine Model of Severe Allergic Conjunctivitis.Cornea，Volume 22(7)Supplement 1，October 2003，pp S13-S18.

［2］M.Teresa Magone，Chi-Chao Chan.A Novel Murine Model of Allergic Conjunctivitis.Clinical Immunology And Immunopathology，1998，87:75–84.

［3］吕秋军.新药药理学研究方法［M］.北京:化学工业出版社，2007，433-434.

［4］徐岩，陈祖基.变应性结膜炎动物模型［M］.眼科研究，2001，19(2):181.

［5］Berdy GJ，Hedqvist B.Ocular allergic disorders and dry eye disease:asslociations，diagnostic dilemmas，and management.Acta Ophthalmol Scand Supp，2000，230:32237.

［6］Xiong C，Chen D，Liu J，et al.A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(5):1850-1856.

［7］宋剑涛，杨薇，高健生，等.川椒方治疗过敏性结膜炎的临床观察.中国中医眼科杂志，2010，20(1):17-19.

(2011-09-08收稿)