转耐盐基因GhNHX1棉花株系耐盐性初步鉴定

吴 霞，吴长艾，上官小霞，马燕斌，翟晓菊，李燕娥

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城 044000；2.山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271018）

我国盐碱土壤的分布区域广阔，总面积为0.33多亿hm2，其中占耕地总面积10%以上的0.13多亿hm2具有农业利用潜力。随着生态环境的恶化，土壤呈现沙漠化、盐碱化的趋势逐年加重，全球盐碱地每年增加100万～150万hm2。为此，利用生物技术改造植物，应用分子育种改良作物耐盐抗逆性状，培育作物耐盐抗逆新品种尤为重要。目前，国内不同单位相继开展了玉米、水稻、小麦等作物的耐盐性研究[1-4]。另外，棉花是盐碱地种植的主要作物之一，转基因耐盐碱棉花的培育是“十一五”转基因重大专项研究内容重点之一。

本研究通过生物技术导入棉花耐盐性基因GhNHX1，旨在使其过量表达来提高棉花植株的耐盐能力。

1 材料和方法

1.1 材料

转基因受体与对照均为陆地棉棉花品系R15，4092为利用农杆菌介导法[5-6]转化外源陆地棉耐盐基因GhNHX1获得的纯合棉花株系，其中，GhNHX1基因编码543个氨基酸。

1.2 抗性检测方法

1.2.1 转基因GhNHX1棉花种子不同盐含量发芽试验 NaCl设置5个不同含量梯度：0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，每个处理分别为40粒种子。种子用15%H2O2灭菌2～3 h，无菌水洗2～3次。在不同盐含量浸种24，48 h后，观察种子的萌发状况。

1.2.2 转基因GhNHX1棉花种子不同盐含量培养基耐盐性检测 所有试验棉花种子经15%H2O2灭菌2～3 h后，用无菌水洗2～3次。盐含量为0的无菌水浸种24 h后，取发芽好的种子种入盐含量为2.0%的1/2 MS种苗培养基中，5 d（120 h）后称量统计棉花苗生物鲜质量。

1.2.3 转基因GhNHX1棉花种子在不同盐含量盆栽耐盐性检测 土壤晾干后加入5个不同NaCl含量的培养基中，盐含量梯度同1.2.1。然后在这一梯度下分别播种4092与对照R15棉花种子，统计出苗率。

2 结果与分析

2.1 转基因GhNHX1棉花种子发芽的耐盐性检测

从表1可以看出，在无NaCl的无菌水中浸种24，48 h后，对照R15与4092发芽率均能达到100%。当增加NaCl含量到0.5%浸种24 h时，对照R15

发芽率降到37.5%，而转基因株系4092发芽率仍为100%；增加浸种时间到48 h，对照R15发芽率增加到85%，而转基因株系4092发芽率仍为100%。当盐含量增加到1.0%，浸种24 h时，对照R15发芽率降到7.5%，而转基因株系4092发芽率为65%；增加浸种时间到48 h，对照R15发芽率增加到60%，而转基因株系4092发芽率为90%。当盐含量增加到1.5%，浸种24 h时，对照R15发芽率降到0，而转基因株系4092发芽率为12.5%；增加浸种时间到48 h，对照R15发芽率增加到10%，而转基因株系4092发芽率为20%。但当盐含量增加到2.0%时，经过24，48 h处理，对照与4092均不能正常发芽。结果表明，对照R15和转基因棉花的发芽率明显受盐含量高低的影响，随着盐含量梯度的增加，对照与转基因株系4092的发芽率均受到不同程度抑制，但是转基因株系4092的耐盐性明显增强。

表1 不同盐含量梯度条件下棉花种子的发芽率 %

2.2 不同盐含量下转基因GhNHX1棉花幼苗的生物鲜质量

对转基因GhNHX1棉花幼苗在不同盐含量条件下的耐盐性生长进行了研究，分别称量统计盐含量2.0%培养基中生长5 d的棉花幼苗鲜质量。从表2可以看出，转基因株系4092棉花幼苗（10株）的鲜质量明显高于对照，其中，总质量及下胚轴、叶、根质量分别比对照增加0.830，0.305，0.302，0.223 g。说明转基因株系4092在含盐量较高的环境中生物鲜质量比对照有较高的增加，生活力得到明显提高，耐盐性生长得到较好的改良。

表2 转耐盐基因棉苗不同组织在盐含量2.0%时的生物鲜质量 g/10株

2.3 不同盐含量下转基因GhNHX1棉花盆栽的出苗率

转基因GhNHX1棉花种子在室内培养基中耐盐性较好，为证实在田间盐碱地中种子的耐盐性和发芽率是否受影响，特利用含盐土壤盆栽试验，对棉花幼苗的出苗概况进行初步统计分析。由表3可知，转基因GhNHX1棉花种子与对照R15在含盐量为0的土壤中出苗率均为100%；在盐含量为0.5%的土壤中，转基因株系4092比对照出苗率提高13.3百分点。而在盐含量为1.0%的土壤中，转基因株系4092比对照出苗率提高3.7百分点。在盐含量为1.5%的土壤中，转基因株系4092比对照出苗率提高6.6百分点。说明转GhNHX1基因的4092株系耐盐性得到了较大提高。

表3 不同盐含量下转基因GhNHX1棉花盆栽出苗率 %

3 结论与讨论

在已有耐盐性研究的报道中，盐胁迫可延迟水稻种子的萌芽和出苗，常会导致种子发芽不齐，发芽率降低[7]。此外，除GhNHX1基因外，棉花中也存在其他与盐胁迫的相关基因，说明棉花耐盐性可能与多个基因相关[7-8]。从本研究不同盐含量梯度的种子发芽率来看，在0.5%～1.5%的盐含量条件下，浸种24 h时，转基因株系4092的发芽率分别比对照高出62.5，57.5，12.5百分点。浸种48 h时，其发芽率分别比对照高出15，30，10百分点。通过对转基因株系4092的生物鲜质量和土壤盆栽出苗率统计分析，得出转基因株系与对照R15相比，生物鲜质量与出苗率均优于对照，耐盐性具有明显的提高。从本研究结果来看，盐分对棉花生长发育的抑制在棉花种子吸水萌发和苗期生长阶段比较严重，在预先通过正常浸种发芽后，其后期出苗率和苗期生长受到的影响较大。本研究说明，转外源基因GhNHX1有助于改良棉花的耐盐性，该基因的RNA表达分析、蛋白表达以及相关的生理生化变化还有待进一步研究。

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