间接竞争ELISA法检测饲料中盐酸克伦特罗的探讨

刘立波

（河北唐县农业局，河北 唐县 072350）

盐酸克伦特罗（CLB）又称盐酸双氯醇氨、氨哮素、克喘素，化学名称为α－（[叔丁氨基）甲基]－4－氨基－3，5－二氯苯甲醇盐酸盐[1]。CLB主要用于治疗人和家畜的支气管哮喘，但其对人体有很强的副作用，其半衰期长，在体内代谢慢，极易积蓄在肝脏、肾脏等器官中。中毒表现主要为肌肉震颤、头疼、心悸等。同时CLB具有蛋白质同化作用，在动物体内代谢过程中促进骨骼肌蛋白质的合成，对脂肪的合成有一定的抑制作用，可以减少脂肪的形成，提高瘦肉率[2]。因此，一段时间以来CLB被作为一种促生长添加剂而倍受重视。

不法饲料生产商和养殖户将CLB加入到饲料或饮用水中，用以促进生猪、牛、羊的生长，提高瘦肉率。通过饲喂会使其残留在动物的内脏及肌肉组织中，人类食用残留CLB的动物产品发生中毒，通常表现为面色潮红、头痛、胸闷、心悸、心慌、骨骼肌震颤、四肢麻木等一系列不良反应。对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病、甲状腺机能亢进、前列腺肥大等疾病的患者有较大的危害甚至危及生命[3]。故当前我国立法禁止将盐酸克伦特罗作为饲料药物添加剂使用。加强对饲料产品中CLB的监测，可以保障食品安全，从而保护人的建康与安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择饲料样本16份作为试验材料，其中8份来自经过河北省饲料检测中心检测的不含盐酸克伦特罗的样本，另外8份来自于销售市场的随机抽样。

1.2 主要仪器和试剂

酶标仪；微量移液器（20、50、100μL）；96孔酶标板1块（包被有偶联抗原）；标准液6瓶：（1 mL/瓶）0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb；高浓度标准品：100 ppb 1mL；酶标二抗7mL；克伦特罗抗体工作液7mL；底物液A液、B液（TMB底物溶液）各7mL；终止液7mL；20×浓缩洗涤液40mL。

1.3 检测原理

盐酸克伦特罗间接竞争ELISA检测试剂盒基于间接竞争性酶联反应原理，在酶标板微孔板上预包被偶联抗原，样本中残留的CLB和微孔板上预包被偶联抗原竞争抗CLB抗体，加入酶标二抗后，用底物显色，样本吸光度值与其所含残留物盐酸克仑特罗的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中CLB的含量[4]。

1.4 试验方法

1.4.1 样品中盐酸克伦特罗的提取

将饲料样本用研钵研碎，用电子天平称取粉碎的样本2.0 g，然后将此样本加入50mL离心管中，加入2mol·L－1的盐酸溶液中，加入蒸馏水16mL，用力反复摇晃，然后放置超声波水浴中超声30 min。用3 000 rpm离心20min，取出上清液加入氢氧化钠溶液2mL（1mol·L－1）混合均匀，将pH调至6.5～7.5，3 000 rpm离心20min，取100μL上清液和900μL蒸馏水混合，取用20μL备用。

1.4.2 样品中盐酸克伦特罗的测定

依据中华人民共和国农业行业标准NY－T1460－2007《饲料中盐酸克伦特罗的测定酶联免疫吸附法》方法测定[5]。

1.5 标准曲线制备

将6个浓度的盐酸克伦特罗的标准溶液（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb）和待测溶液按限量法测定步骤测定相应的吸光度值。百分吸光率的计算法见式（1）。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0 ppb标准溶液的平均吸光度值

以百分吸光率为纵坐标，以克仑特罗标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 饲料样品中盐酸克仑特罗的测定结果

饲料样品中盐酸克仑特罗的测定结果见表1。

表1 饲料样本检测结果

依据中华人民共和国农业行业标准NY－T438－2001《饲料中盐酸克伦特罗的测定》，中华人民共和国农业行业标准NY－T1460－2007《饲料中盐酸克伦特罗的测定酶联免疫吸附法》，中华人民共和国国家标准GB/T22147－2008《饲料中沙丁胺醇，莱克多巴胺，盐酸克伦特罗的测定液相色谱质谱联用法》中规定CLB检测限为0.01mg·kg－1，CLB定量限为0.05mg·kg－1，饲料在处理过程中被稀释100倍，表1中检测样1～6是测定饲料中添加CLB用以测定回收率，样本7～17是抽检的饲料样本，可以看出，目前市场上的饲料产品中没有添加违禁药物CLB，饲料的质量安全可靠[5－6]。

2.2 样品阳性添加物回收率

在经本方法测定过的不同饲料样本中准确加入一定量的盐酸克伦特罗，按同样的操作过程提取、测定，计算回收率。平均回收率为96.9%。阳性添加物回收率结果见表2。

表2 阳性添加物回收率

通过表2可以看出，阳性添加回收率平均达到96.9%，符合试剂盒中所规定的85%～95%的回收率数值，表明此次检测准确可靠。贾涛研究表明，酶联免疫方法具有操作简便、灵敏度高、成本低的优点，盐酸克伦特罗酶朕免疫反应测试盒为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速检测克伦特罗残留的方法，该试剂盒的提取方法能达到75%～95%的回收率，可以不需用有机溶剂并在10～30min完成提取过程。该法具有灵敏度高（0.05 ng·g－1）、检测下限低（肉类/脂肪 0.025 ng·g－1、尿液 0.05 ng·mL－1、饲料0.2 μg·kg－1）、检测时间≤2 h；重复性高的特点[7]。

3 结论

间接竞争ELISA法可以直接用于测定饲料中盐酸克伦特罗含量，具有良好的灵敏度和稳定性。

[1]陈启佳.盐酸克伦特罗在肉制品中的危害及其检测方法研究进展[J].肉类研究,2011（6）:58－60.

[2]王海花,黄素珍.盐酸克伦特罗的危害性与检测[J].动物医学进展,2003（4）:41－43.

[3]翟福丽,赖克强,张衍亮,等.动物性食品中β-兴奋剂残留概述[J].食品科学,2011（5）:351－356.

[4]Jiang JQ,Zhang H T,Wang Z L.Preparation and Identification ofanti－RactopamineMonoclonalantibodies[J].IPCBEE,2011（3）:78－81.

[5]中华人民共和国农业行业标准.NY－T1460－2007饲料中盐酸克伦特罗的测定.酶联免疫吸附法[S].北京:中国农业出版社,2008.

[6]中华人民共和国国家标准.GB/T22147－2008饲料中沙丁胺醇,莱克多巴胺,盐酸克伦特罗的测定.液相色谱质谱联用法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[7]贾涛.酶联免疫法检测盐酸克伦特罗的试验报告[J].北京农业,2007,33:47－54.