针刀松解法对肩周炎家兔模型局部组织形态学及TGF-β1的影响

郭长青，冯 涛，陈幼楠，刘乃刚，袁 红，孙红梅，吴海霞，许 红，韩森宁，杨淑娟

(1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.卫生部中日友好医院 中医针灸科，北京 100029；3.北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

肩周炎有着明显的病理分期，Bunker TD[1]将其分为疼痛期、僵硬期、缓解期。徐洪璋等[2]通过对文献的分析认为针刀可直接作用于病变局部，松解黏连,因此主要适用于肩周软组织有明显黏连的类型。本研究通过观察针刀松解法对不同病理分期肩周炎家兔模型局部组织形态学、转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1，TGFβ1)的影响，探讨针刀松解法对肩周炎干预作用的可能机制，并探寻针刀松解法治疗肩周炎的最佳介入时间，为肩周炎的针刀临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性新西兰兔48只，兔龄(6±0.5)个月，体质量(2.5±0.5)kg，北京市海淀区兴隆实验动物养殖场提供，批号：SCXK(京)2006-0001，在北京中医药大学基础医学院实验动物中心动物室喂养。适应性饲养3 d后随机分为正常组、模型组、电针组、针刀A组(疼痛期干预)、针刀B组(僵硬期干预)、针刀C组(疼痛期及僵硬期均干预),每组8只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.2 主要仪器设备 0.4 mm×40 mm汉章牌Ⅰ型针刀，北京华夏针刀医疗器械厂；0.25 mm×25 mm环球牌无菌针灸针，苏州针灸医疗器材有限公司；5415R高速离心机，德国Eppendorf公司；MDF-U50A超低温冰箱，日本SANYO公司；FS/FAS5030石蜡切片机，德国LETIZ公司；Nikon显微镜，日本Nikon株式会社；ZD-9556水平摇床，江苏太仓市实验设备厂；SHZ-88台式水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 主要试剂 75%乙醇:北京海德润制药有限公司；碘伏消毒剂：武汉同济美迪生科技有限公司；0.9%氯化钠注射液：四川科伦药业股份有限公司；水合氯醛：北京化学试剂厂；37%～40%福尔马林液，北京北化精细化学品有限责任公司；二甲苯,北京北化精细化学品有限责任公司；石蜡，北京化学试剂公司；兔转化生长因子β1(TGFβ1)ELISA测定试剂盒：北京尚柏恒通公司。

1.4 造模方法 参照文献[2]的造模方法进行造模。首先用弯剪剪除兔右肩部外侧约6 cm×6 cm的兔毛，然后使兔俯卧，将两后肢和左前肢固定于兔台，右前肢与水平摇床固定连接。以240次/min频率、1.5 cm振幅平行摇动肩关节，每天持续4 h，连续3 d。然后将肩袖袋(自制)以水浸湿后装冰块(每块3 cm×3 cm×1.5 cm，每袋每次装4块)外敷兔右肩部，当冰块融化将尽时更换，每天持续4 h,连续3 d。第1次摇动兔肩关节当日记为实验第1天。根据熊昌源等[3]的病理观察结果确定病理分期。正常组造模期间每天固定于兔台4 h，共6 d。

1.5 处理方法 正常组和模型组正常饲养，不做干预处理；电针组进行电针干预，在实验第9天开始，每周3次，共治疗12次；针刀A组在实验第9、16天各进行1次针刀干预，共2次；针刀B组在实验第23、30天各进行1次针刀干预，共2次；针刀C组在实验第9、16、23、30天各进行1次针刀干预，共4次。

针刀方法：首先将模型兔固定，然后对患侧肩部软组织进行触诊，分别在结节间沟、大圆肌起始部、冈上肌腱与肌腹结合部3处寻找到阳性反应点后进针刀，做纵行疏通与横行剥离2～3刀，出针刀后按压1 min，防止出血。

1.6 取材 各组动物均于实验第33天进行取材。首先采用10%水合氯醛按2 mL/kg体质量进行耳缘静脉麻醉，麻醉完全后，腹主动脉取血4 mL，室温下血液自然凝固10～20 min后，冷冻离心机离心(4 ℃，3 000 r/min，离心20 min)，取上清液,置于-70 ℃冰箱中保存待测；取血后迅速进行肩关节周围软组织取材，分别取肱二头肌、冈上肌、冈下肌、大圆肌相同位置、相同大小的组织块，将组织块置冰面上，0.9% Nacl注射液漂洗干净，除去血迹，滤纸吸干，称质量，按10%的比例往组织中加入匀浆介质(由pH 7.4，0.01mol/L Tris-Hcl，0.000 1 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖,PMSF 0.1 mmol/L，BSA0.1%组成)，用眼科剪于冰水浴中剪碎组织块，然后在冰浴中超声匀浆30 s,之后用冷冻离心机离心(4 ℃,2 000 r/min，10 min)。取上清液,置于-70 ℃冰箱中保存待测。然后取肱二头肌肌腱、肩关节滑膜囊，位置和大小保持一致，将组织块放在冰面上，用0.9%氯化钠注射液冲洗，放入20%甲醛溶液固定1周，自来水冲洗24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片(片厚6 μ),常温保存。之后腹主动脉放血处死动物。

1.7 指标检测 1)组织形态学观察：组织切片进行HE染色，光镜观察照相。2)TGFβ1检测：采用酶联免疫吸附法检测血清和局部肌肉组织匀浆中TGFβ1含量。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

2 实验结果

2.1 针刀松解法对兔局部组织形态学的影响 正常组(图1，A)滑膜细胞多为1层，有些部位也可见2～3层，在皱襞较多处滑膜细胞可达5～6层。滑膜细胞深层结构疏松，可见少量毛细血管。模型组(图1，B)滑膜细胞多为1～2层，滑膜上皮深层毛细血管较多，其内可见较多红细胞，未见明显炎细胞浸润。电针组(图1，C)、针刀A组(图1，D)、针刀B组(图1，E)、针刀C组(图1，F)滑膜细胞排列基本同正常组，可见滑膜细胞多为1层，有些部位也可见2～3层，在皱襞较多处滑膜细胞可达5～6层。滑膜细胞深层结构疏松，可见少量毛细血管。

正常组肌腱(图2，A)外膜由结缔组织包绕，最外层上皮细胞为立方细胞1～2层，排列整齐，腱纤维排列整齐。模型组肌腱(图2，B)外膜上皮细胞排列不整齐，上皮细胞增多可达4～5层，上皮深层下行纤维增多，结构更加致密，其深层腱纤维排列不够整齐。未见明显炎细胞浸润。电针组肌腱(图2，C)、针刀A组(图2，D)、针刀B组(图2，E)、针刀C组(图2，F)病理改变基本相同，肌腱的外膜(腱鞘脏层)上皮细胞增生，但较模型组少，多为2～3层。上皮下结缔组织也较致密，其深层腱纤维排列较整齐。

2.2 针刀松解法对兔血清和局部肌肉组织中TGF-β1的影响 见表1。

3 讨论

转化生长因子β是一类有着多种生物学效应的蛋白质超家族,在哺乳动物中发现有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3个亚型，其中TGF-β1是一种具有巨大的生物学活性的与伤口愈合有关的细胞因子，也是纤维化和瘢痕形成的病理过程中的关键性细胞因子[5-6]。TGF-β1可促进细胞外基质的合成，一方面TGF-β1增加细胞外基质蛋白的合成如胶原蛋白、纤黏连蛋白、糖蛋白的表达和分泌，加强细胞黏附蛋白受体的转录、翻译和处理过程；另一方面减少基质降解蛋白酶的合成，增加这些蛋白酶特异抑制剂如纤维蛋白溶酶原激活抑制物与组织特异性金属蛋白酶抑制物的合成。Rodeo SA等[7]研究表明原发性冻结肩和继发性冻结肩患者肩关节囊中TGF-β及其受体表达均明显升高，李宏云等[8]也发现冻结肩患者肩袖间隙组织中转化生长因子-β mRNA和基质金属蛋白酶表达水平均明显升高，说明转化生长因子-β在冻结肩的发生和发展过程中有重要作用。

表1 各组兔血清和局部肌肉组织中TGFβ1的变化±s) ng/mL

A正常组；B模型组；C电针组；D针刀A组；E针刀B组；F针刀C组

A正常组；B模型组；C电针组；D针刀A组；E针刀B组；F针刀C组

本实验组织形态学结果表明针刀松解法能改善局部病理状态，减少滑膜增厚和肌腱纤维增生，促进组织的修复。TGF-β1的检测结果表明针刀松解法对模型兔血清和局部肌肉组织中异常增高的TGFβ1含量有一定的良性调节作用，可显著降低其含量(P<0.05，P<0.01)；对血清TGF-β1的调节各治疗组大致相同，未出现显著性差异(P>0.05)，而对局部肌肉组织中TGF-β1的调节以针刀A组调节作用最优，电针组和针刀C组相当；针刀B组次之，可能与针刀B组只在僵硬期干预，治疗2次后，随即取材，针刀的作用尚未影响到局部组织中TGF-β1的含量有关。

针刀松解法是针刀医学的一种重要操作方法，它将现代医学的手术刀与中医学的针灸针有机的融合为一体，在治疗中既可直接作用于病变部位，发挥“刀”的松解作用，又可舒筋通络，发挥针灸针的良性刺激作用，因此在治疗慢性软组织损伤等疾病方面临床疗效较传统针灸更为显著。针刀可直接作用于肩周炎病变局部的结筋病灶点，通过对病灶的切割松解，剥离局部组织的黏连，消除病灶点，恢复经筋的正常功能，达到治疗目的。本实验结果证实了针刀松解法对肩周炎模型兔的治疗作用，同时实验结果也表明早期干预对肩周炎模型兔病理有确切的改善作用，为临床针刀治疗肩周炎应尽早介入提供了实验依据。

[1]Bunker T Danthony P P.The pathology of frozen shoulder.A Dupuytren-like disease[J].The Journal of Bone and Joint Surgery,1995,77(5):677-683.

[2]徐洪璋,余斌.小针刀疗法治疗肩周炎研究进展[J].第一军医大学分校学报,2002,25(2):148-151.

[4]熊昌源,毕学薇,刘松林,等.持续机械劳损加冰敷复制实验性兔肩关节周围炎的病理学观察[J].中医药研究,1995(5):52-53.

[5]LI H-,yao G-h,xia C-s.Effects of transforming growth factor beta-1 on proliferation and collagen production of tendon sheath fibroblasts,epitenon tenocytes and endotenon tenocytes[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2007,11(41):8404-8407.

[6]Ngo M,phan H,longaker M T,et al.Differential expression of transforming growth factor-beta receptors in a rabbit zone II flexor tendon wound healing model[J].Plastic and Reconstructive Surgery,2001,108(5):1260-1267.

[7]Rodeo SA Hannafin J,atom J,et al.Immunolocalization of cytokines and their receptors in adhesive capsulitis of the shoulder[J].Journal of Orthopaedic Research:Official Publication of the Orthopaedic Research Society,1997,15(3):427-436.

[8]李宏云,陈世益,翟伟韬,等.冻结肩患者关节囊组织中TGF-β和MMPs表达研究[J].上海交通大学学报(医学版),2009,29(11):1363-1366.