猪瘟、高致病性猪蓝耳病和口蹄疫疫苗免疫试验报告

周春炎 周昌龙 关伟伟

（江苏省如皋市畜牧兽医站，如皋 226500）

猪瘟、高致病性猪蓝耳病和口蹄疫疫苗免疫试验报告

周春炎 周昌龙 关伟伟

（江苏省如皋市畜牧兽医站，如皋 226500）

猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染的传染病。具有高度传染性和致死性。高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）病毒变异引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上，育肥猪可发病死亡。这2个传染病的临床症状、病理变化有相似之处，不易区分。为寻求最佳免疫方案，本实验研究采用2病疫苗的不同剂量、不同疫苗品种、不同疫苗组合等进行实验，同时，进行免疫抗体检测。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 疫苗

1.1.1.1 猪口蹄疫O型灭活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）（WA）批号：H110206J 规格：100ml/瓶 厂家：××生物科技股份有限公司；口蹄疫O型灭活疫苗（OZK/93株+OR/80株）（WB）批号：0132059 规格：50 ml/瓶 厂家：××生物药品有限公司。

1.1.1.2 猪瘟活疫苗（细胞源）（CSFV）批号：101005 规格：20头份/瓶 厂家：××生物股份有限公司。

1.1.1.3 猪蓝耳活疫苗批号：1011099-2规格：20头份/瓶 厂家：××股份有限公司。

1.1.2 主要实验仪器和试剂 采血器，注射器，酶标仪，生化培养箱，微量加样器等，O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，猪瘟病毒抗体检测试剂盒，ELISA猪繁殖和呼吸综合征抗体检测试剂盒。

1.1.3 实验猪 如皋某生猪养殖场。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序 各实验组于19日龄免疫猪蓝耳活疫苗2头份，具体免疫情况详见表1。

1.2.2 血样采集 5组实验猪，分别在27、57、87、118、149日龄采集血样，每次4 ml。27、57日龄免疫前采血样。

1.2.3 抗体免疫效果检测 采用ELISA的方法进行免疫效果监测。猪瘟病毒抗体检测试剂盒厂家：北京爱德士元亨生物科技有限公司，批号：43220-V731。LSI猪繁殖和呼吸综合征抗体检测试剂盒厂家：北京天之泰生物科技有限公司 批号：5-VETPRA-012。

具体操作如下：

1.2.3.1 猪瘟抗体检测

1.2.3.1.1 加样 每个检测孔分别加入50 μl样品稀释液，分别将50 μl阳性对照和阴性对照加入到相应的对照孔中，注意不同对照的吸头需要更换，分别将50 μl被检样品加入到剩余的检测孔中，注意更换吸头；

1.2.3.1.2 孵育 将微量反应板用振荡器振荡，混匀反应板中的溶液，与室温下（18℃～25℃）孵育2 h，注意封板或置于湿盒中，避免液体挥发。

1.2.3.1.3 用300 μl洗涤液连续洗ELISA板3次，在吸水纸上甩干。

1.2.3.1.4 加入100 μl辣根过氧化物酶结合物，封板，室温温育30 min。

1.2.3.1.5 同上。洗板3次，甩干。每孔加100 μl底物溶液，避光、室温下温育10 min。

1.2.3.1.6 每孔加入终止液100 μl，混匀；立即置波长450 nm的酶标仪，读取OD值。

1.2.3.2 猪蓝耳病抗体检测

1.2.3.2.1 用样品稀释液将样品进行200倍稀释，先吸取5 μl的样品加入95 μl样品稀释液中，混匀，再吸取5 μl稀释了20倍的液体加入ELISA反应板孔，再加入45 μl的样品稀释液；

表1 各实验组免疫情况一览表

1.2.3.2.2 分别将50 μl阳性对照、阴性对照、及200倍稀释的样品在反应板孔。

1.2.3.2.3 盖上膜，在37℃作用60 min。

1.2.3.2.4 去膜，用300 μl洗涤液连续洗ELISA板3次，在吸水纸上甩干。

1.2.3.2.5 加入50 μl酶标抗体，封板，37℃温育60 min。

1.2.3.2.7 同上洗板3次，甩干。每孔加50 μl底物溶液，避光、20℃～25℃下温育10 min。

1.2.3.2.8 每孔加入终止液50 μl，混匀；立即置波长450 nm的酶标仪，读取OD值。

2 结果

2.1 临床观察

开展猪蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等疫苗免疫注射后，1周内临床观察全部实验猪均无疫苗反应出现。后期出现5头生猪死亡，通过养殖场技术人员发病前的观察及死亡后解剖诊断为肠炎和胸膜肺炎，与疫苗无关。

2.2 抗体检测

2.2.1 猪瘟抗体

猪瘟阴阳性的判断：猪瘟阴阳性于OD值成反比。大于临界OD值判为阴性，且随着OD值得升高，阴性抗体滴度越低；小于临界OD值判为阳性，且随着OD值得降低，阳性抗体滴度越高。

从表3可见，实验组内的猪群在经猪瘟免疫后抗体阳性率均有不同程度上升，对比5个组的抗体阳性率可见，C组的阳性率呈直线上升，到第4次所采样中阳性率达100%。A、B、D、E4个组的与其比较，在前3次采样中除B组阳性率高于C组外，其他均低于C组，到第4、第5次采样后阳性率全都低于C组。其中，D组第1次采样所测抗体为母源抗体阳性率达90.91%，在进行1次猪瘟免疫后在第2次免疫前采样所测抗体阳性率降为0%，再见过2次免疫后抗体阳性率才有所上升。总之，C组猪瘟免疫方案从免疫效果看出，可值得推广；母源抗体高的个体在免疫后会产生一些中和，促使抗体下降，保护率下降，这就要求在疫苗免疫之前做好抗体检测对后期疫苗的防疫有着直接的指导意义。

从图4可以看出，实验A组猪瘟第1次到第2次采样OD值有所升高，是由于母源抗体因素，产生中和，导致抗体滴度降低；在第2次免疫之后，到第3次、第4采样后所测OD值大部分均呈下降趋势，到第5次采样所测OD值大部分呈反弹趋势，表示抗体滴度在降低，保护率有所下降。

由图5可以看出，实验C组猪瘟第1次到第2次采样OD值下降，明显可见所测母源抗体OD值比较高，即抗体滴度低，与免疫抗原产生的反应小，随着疫苗在体内刺激机体产生抗体到第2～第4次采样后所测OD值呈下降，到第5次采样所测OD值成上升趋势，是由于免疫后随着时间的推移，机体内的抗体滴度有所下降。

图2 猪瘟纯阳性率

图3 猪瘟抗体OD值

图4 C组猪瘟抗体OD值

2.2.2 高致病性蓝耳病抗体检测

本次实验猪在19日龄全部免疫2头份猪蓝耳病活疫苗1次，在27、57、87、118、149日龄采血样进行抗体检测。该检测利用特异的PRRS被包被在96孔板上，在反应过程中，检测样本被加入反应孔中，样本中的特异性抗体会与孔中包被的特异性抗原反应，在洗板的过程中不会被清洗掉，当添加酶标复合物时，这些酶标复合物就会与猪的抗体发生反应。没有结合的酶标复合物在洗板的过程中被清洗。在加入对氧化酶敏感的可以显色底物。显色的颜色深浅与样本所含PRRS的抗体浓度成正比。抗体阴阳性界定以临界值为界，低于该临界值为阳性，低于临界值为阴性，个体抗体滴度与所测OD值成正比。

从图6可以看出，C、D组PRRS抗体滴度随着时间的推移到第4次采样所测OD值均呈上升趋势，到第5次部分呈下降，分析由于免疫后时间过长，抗体有所下降。可见PRRS的免疫超过一定时间必须加强免疫1次，每次间隔时间大约为4个月左右。

本试验报告基于2011年江苏省农业三项工程，项目编号：sx（2011）181。

项目名称：生猪口蹄疫O型疫苗（O/MAY98/BY/2010株）免疫试验与推广。