藤茶植株叶果与组培物中二氢杨梅素含量的比较研究

周 耀，丰 来，周 政

（湖南农业大学，湖南 长沙 410128）

藤茶，俗称茅岩莓茶、端午茶、藤婆茶，学名显齿蛇葡萄（A.grossedentata），为葡萄科，蛇葡萄属木质藤本。它是粤蛇葡萄（A.cantoniesi）的变种，主要分布于广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省[1]。藤茶中主要活性成分二氢杨梅素在该植物幼嫩芽头部位含量最高[2]。二氢杨梅素（3，5，7，3′4′5′-六羟基-2,3 双氢黄酮醇 dihydromyricetin，DMY）是一种多酚羟基双氢黄酮醇，又称蛇葡萄素，属黄酮类化合物[3]。二氢杨梅素除具有黄酮化合物的清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎抑菌等普通特性外，其在解除醇中毒、降低血脂和血糖水平，提高SOD活性以及保肝护肝等方面具有特殊功效，具有明显拮抗Na和高K所致的兔胸主动脉条收缩反应及钙拮抗作用，且毒性低，可作为抗心律失常、心肌缺血、高血压的新型药物[4]。试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定藤茶嫩叶、叶片、老叶、果实、愈伤组织、悬浮培养液中二氢杨梅素的含量，重点探讨了愈伤组织培养法生产二氢杨梅素的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪 器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪，L 27420紫外可见光检测器，BF22002色谱工作站，AL204万分电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.1.2 试 剂 二氢杨梅素对照品（色谱级，纯度>98%）；甲醇（色谱纯）；超纯水；其它试剂均为分析纯。

1.1.3 材 料 供试材料藤条，春天采自湖南省张家界，移栽到湖南农业大学实验基地。9月中旬采集3种叶片，10月底采集果实，均于48℃烘干，粉碎过60目筛备用。

愈伤组织培养选择植株生长健状，无病虫害的藤茶叶片、叶柄、茎段、茎尖等作为外植体。取长势良好、无染菌、黑斑较少的愈伤组织，48℃烘干粉碎，过60目筛备用。

悬浮细胞培养选择愈伤培养继代3次后，状态疏松、生长速度快的愈伤组织转入到液体培养基中[5]。选择镜检有一定活细胞数量的同批悬浮液过滤，液体混合备用。

1.1.4 培养基 愈伤诱导培养基：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L+蔗糖2%+琼脂 0.7%；继代培养基：MS+2，4-D 2mg/L+蔗糖 2%+琼脂 0.7%；悬浮培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖2%。

1.2 试验方法

1.2.1 液相色谱条件 参照周雪仙等[5-6]方法，C18柱，流动相为甲醇∶水（36∶64），应用前经过 0.45 μm微孔滤膜抽滤，超声脱气，流速为1.0 mL/min；进样时为 20 μL，柱温 30℃；检测波长 291 nm。

1.2.2 对照品溶液的制备与计算[7]取二氢杨梅素对照品5 mg，加水溶解并定容至50 mL，摇匀，即得（0.1mg/1mL）,0.45 μm 微孔滤膜过滤，取 20 μL 进样，面积外标法定量。计算方法：

X=[A样×C标×B样/（A标×M）]×100%

式中：X——样品中二氢杨梅素含量（%）；A样——样品图谱中二氢杨梅素对应的峰面积；A标——对照品图谱中二氢杨梅素对应的峰面积；C标——二氢杨梅素对照品的浓度（mg/mL）为0.1；B样——溶液稀释倍数；M——样品量（mg或mL）

1.2.3 供试液制备 嫩叶、叶片、老叶、果实、愈伤组织各称取样品粉末1 g，置250 mL三角烧瓶中，加20倍水于97℃水浴30 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液备用，沉淀重复上述操作两次，合并3次离心后的上清液，10倍95%乙醇沉淀，10 000 r/min离心5 min，留上清液，旋转蒸发浓缩至50 mL，精密量取浓缩液1 mL，根据预作试验分别定容到适当体积。超声30 min，取适量用0.45 μm微孔滤膜过滤即得样品溶液，取20 μL进样分析。

细胞悬浮液量取200 mL，10倍95%乙醇沉淀，10 000 r/min离心5 min，留上清液，旋转蒸发浓缩50 mL，精密量取浓缩液1 mL，定容到5 mL。超声30 min，取适量用0.45 μm微孔滤膜滤过即得样品溶液。取20 μL进样分析。

2 结果与分析

2.1 二氢杨梅素对照品的测定

由图1可知，二氢杨梅素对照品大约在7.5 min开始出现峰，大约在8.5 min时出峰，响应时间7.828 min，峰面积为 3 849 165，高度为 268 796。即A标为3 849 165，C标为0.1 mg/mL。

图1 二氢杨梅素对照品HPLC图谱

2.2 藤条嫩叶中二氢杨梅素含量的测定

将1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到10 mL，然后过膜上样。由图2可知，嫩叶二氢杨梅素响应时间7.902 min，峰面积A样为19 652 356，高度为1 102 075。稀释倍数B样为50×10=500，求得X，即嫩叶中二氢杨梅素含量为25.528%。

图2 藤条嫩叶二氢杨梅素HPLC图谱

2.3 藤条叶片中二氢杨梅素含量的测定

将1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到5 mL，然后过膜上样。由图3可知，叶子二氢杨梅素响应时间7.944 min，峰面积A样为21 106 641，高度为11 589 752。稀释倍数B样为50×5=250，求得X，即叶片中二氢杨梅素含量为13.709%。

图3 藤条叶片二氢杨梅素HPLC图谱

2.4 藤条老叶中二氢杨梅素含量的测定

将1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到50 mL，然后过膜上样。由图4可知，老叶二氢杨梅素响应时间7.980 min，峰面积A样为2 053 457，高度为144 301。稀释倍数 B 样为 50×50=2 500，求得 X，即老叶中的二氢杨梅素含量为13.337%。

图4 藤条老叶二氢杨梅素HPLC图谱

2.5 藤条果实中二氢杨梅素含量的测定

将2.1.4中量取的1 mL溶液定溶到5 mL，然后过膜上样。由图5可知，果实二氢杨梅素响应时间7.936 min，峰面积A样为9 630 913，高度为649 830。稀释倍数B样为50×5=250，求得X，即果实中二氢杨梅素含量为6.255%。

图5 藤条果实二氢杨梅素HPLC图谱

2.6 藤条愈伤组织物中二氢杨梅素含量的测定

将1.2.3中量取的1 mL溶液定溶到10 mL，然后过膜上样。由图6可知，愈伤二氢杨梅素响应时间7.999 min，峰面积A样为8 942 537，高度为592 680。稀释倍数B样为50×10=500，求得X，即愈伤中二氢杨梅素含量为11.616%。

图6 藤条愈伤组培物二氢杨梅素HPLC图谱

2.7 藤条细胞悬浮培养液中二氢杨梅素含量的测定

由图7可知，悬浮液二氢杨梅素响应时间8.027 min，峰面积A样为255 303，高度为11 440。稀释倍数B样为50×5=250，因为悬浮液是取的200 mL，所以M是200，求得X，即悬浮液中二氢杨梅素含量为0.829%。

图7 藤条细胞悬浮液二氢杨梅素HPLC图谱

3 讨论

试验结果表明，愈伤组织中二氢杨梅素含量与叶子中二氢杨梅素含量接近，可能是生长力旺盛的组织合成二氢杨梅素能力强，而悬浮液与愈伤组织中的二氢杨梅素含量相距很大，推测该次生代谢物的合成对组织的活性存在很大的依赖性，由于愈伤组织尚具备诱导分化的能力，而悬浮细胞已完全丧失细胞分化能力的潜力，推测二氢杨梅素的合成与促进细胞分化的因素相关。试验说明愈伤组织诱导分化能力较强。利用愈伤组织培养生产二氢杨梅素值得进一步深入研究。

[1]Liu J X ，Zhou T O.A pharmacognostical study on“Tengcha”，Bigdentata Ampelopsis（Ampelopsis grossedentata）.Chinese Tradition Herb Drugs，1999，30（6）：459-463.

[2]张友胜，杨伟丽，熊皓平.RP-HPLC法测定显齿蛇葡萄植物中杨梅素的含量[J].中草药，2001，32（11）：983-985.

[3]魏 捷.紫外分光光度法测定显齿蛇葡萄各部分蛇葡萄素含量[J].海峡药学，2002，14（5）：62.

[4]何桂霞，裴 刚，周天达，等.显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的含量测定[J].中国中药杂志，2000，25（7）：423-425.

[5]王晶晶，蔡 赫，李然红，等.非洲凤仙花细胞悬浮培养条件的优化[J].牡丹江师范学院学报（自然科学版），2008，68（3）：13-14.

[6]何桂霞，裴 刚，杨伟丽，等.HPLC测定藤茶不同采收时期及不同部位的二氢杨酶素含量[J].中成药，2004，26（3）：210-212.

[7]王春娥，潘振球，冯家力，等.HPLC法测定保健食品中二氢杨梅素的研究[J].中国卫生检验杂志，2006，16（6）：694，732.