猪O型口蹄疫病毒温度敏感突变株部分基因的PCR扩增及序列分析

刘 航，杨晓燕，侯相民，田永强

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）感染偶蹄类动物后引起的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。家畜中牛、猪、山羊、绵羊等均为易感动物[2]。FMDV属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，主要有 7 个血清型，分别为：A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3以及AsiaI型，每个血清型又包含若干个亚型。FMDV血清型众多，传染性极强，给世界多个国家造成了严重的经济损失，严重影响了世界畜牧业的发展[3]。FMDV基因组由包含大约8 500个核苷酸的单股线状RNA组成。口蹄疫P1编码区决定着病毒的抗原性和血清型，是研究分子流行病学、毒株演化关系和基因工程疫苗的基础[4-6]。笔者根据O型FMDV全基因组序列设计了5对针对目的基因的引物，通过PCR扩增得到目的基因。对猪O型FMDV的强弱毒株基因进行克隆与序列分析，以期进一步扩充我国口蹄疫病毒毒株基因资料库，为口蹄疫防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 猪O型口蹄疫病毒和IB-RS-2系传代细胞，为兰州兽医研究所传染病室分离冻存；感受态细胞JM109以及表达载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司。

1.1.2 试 剂 培养细胞的溶液10×DMEN、三抗、10×EDTA、7.5%NaHCO3、Taq Polymerase、AMV 反转录酶、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18、质粒小提试剂盒以及胶回收试剂盒等均为大连宝生物公司产品。RNA提取试剂盒为Invitrogen公司产品。其他常规试剂均为实验室分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 IB-RS-2系传代细胞的复苏与病毒传代将实验室冻存的IB-RS-2系传代细胞从液氮中取出，并于38℃水浴中快速融化。用75%酒精消毒细胞管，然后用新鲜配制的细胞培养液（含20%犊牛血清）将细胞释成约2×105个/mL，并于细胞培养瓶中培养。细胞培养3～5代后，用不含血清的培养液清洗细胞2次，然后加入1 mL猪O型口蹄疫温度敏感株病毒液，放置于37℃培养箱内。1 h后再加入不含血清的新鲜培养液，放入26℃温箱内培养观察。待细胞明显发生CPE时，收集细胞并于-70℃冰箱冻存。将收集的病变细胞反复冻融3次后，吸取1mL再次感染新的IB-RS-2系细胞。以同样的方法传毒3代后，收集细胞提取病毒总RNA。

1.2.2 FMDV总RNA的提取及cDNA的扩增RNA的提取方法按照TRIzol LS Reagent试剂盒（Invitrogen）操作说明书进行。病毒RNA提取方法按照QIAGEN公司的RNA提取试剂盒操作说明书进行。然后以提取的RNA为模板，Oligo（dT）18为引物，利用AMV逆转录酶合成cDNA。扩增体系为 ：5 ×Reverse Transcriptase Buffer 5 μL，10 mM dNTP Mixture 3 μL，5 U/μL AMV Rrverse Transcriptase XL 2 μL ，40 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，RNA 12 μL ，N2 primer 1 μL，Oligo dT 引物 1 μL，42℃保温 1 h。

1.2.3 引物设计 根据FMDV全基因组序列，设计了 5 对针对 L 区、P1、P2、P3（3C、3D）区基因片段的引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4 基因的克隆 以合成的O型口蹄疫cDNA为模板，进行PCR扩增：95℃预变性5 min；94℃ 变性 1 min，55℃复性 45 s，72℃延伸 1 min，共 30 个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经切胶回收纯化后连接至pMD18-T载体，再将连接产物转化到感受态细胞JM109内，挑斑并提取重组质粒进行初步PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒送上海生物工程有限公司进行测序鉴定，并将测序结果用生物软件DNASTAR进行拼接。

2 结果与分析

2.1 病毒的传代

将实验室冻存的猪O型FMDV温度敏感株感染IB-RS-2系细胞3代后，用显微镜观察正常细胞与病毒感染后细胞的形态。观察结果如图1所示，正常的IB-RS-2系传代细胞的形态是细胞致密，形态小而且清晰透亮；接毒的IB-RS-2系传代细胞的形态是细胞脱落，形态不清，细胞颗粒较多且细胞之间出现较大的间隙。

2.2 目的基因的扩增

将病变的IB-RS-2细胞裂解后，提取病毒总RNA，并通过RT-PCR反转录出cDNA。以合成的引物进行PCR扩增，成功扩增出了与预计长度相符合的目的产物。扩增结果如图2所示，L、P1、P2、P3（3C、3D）区基因扩增出的目的条带大小分别为603、2 208、1 464、639、1 410 bp，均与预期的扩增目的片段大小相符。

2.3 目的基因的测序与序列比对

将扩增的目的基因用胶回收试剂盒纯化回收后连接到pMD18-T载体上，送上海生工进行测序。将获得的测序结果拼接后与野生型猪O型FMDV序列进行比对，两者的同源性为88%。

将O型温度敏感株FMDV序列与O型缅甸98FMDV毒株序列进行比对及分析，从O型口蹄疫病毒温度敏感株感染293M细胞的结果来看，其对细胞的毒力明显下降，并且其侵染细胞的最适温度降为26℃，不再是37℃。以O型口蹄疫病毒缅甸98毒株基因序列作为参考，与温度敏感株基因序列进行比对，结果如下：两者L区基因的碱基错配率占L基因全长的12%，错配碱基分布均匀，无明显规律，L基因编码的蛋白是FMDV毒力强弱的重要因子，因此推测L区基因的突变是导致温度敏感株毒力下降的主要原因；P1区是FMDV的蛋白外壳编码区，其碱基错配率较低，FMDV保守区域的碱基都没有发生突变；P2区碱基错配率最低；P3区碱基错配率较高，但主要集中在3A和3B部分，3D区碱基非常保守。从各部分编码蛋白功能来看，3D为RNA依赖的RNA聚合酶，能够催化病毒RNA的合成，对于病毒的自我复制非常重要，因此其碱基序列非常保守，而3A、3B区与病毒侵染宿主的能力有关。

3 讨论

笔者将实验室冻存的猪O型口蹄疫病毒温度敏感突变株在IB-RS-2系传代细胞（猪肾的异倍体细胞）中传毒5代后提取病毒总RNA，反转录得到了cDNA，并根据GenBank中提交的FMDV基因序列设计各区段基因引物，通过PCR扩增得到了与预期相符的O型口蹄疫病毒温度敏感株的L、P1、P2和P3区目的基因片段。测序及序列比对结果表明，获得的各区序列拼接后与野生型猪O型FMDV序列两者同源性为88%，而O型口蹄疫病毒温度敏感株毒力下降及温度敏感的原因可能是其L基因和P3区部分基因碱基突变所致，具体突变部分还有待进一步研究。

[1]Li J，Lin T，Gao S D，et al.Expression，purification and activity detection of VP1 of A-type FMDV[J].Agricultural Science&Technology，2010，11（2）：23-26.

[2]鲁 彬.口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析[J].中国兽医学，2006，36（10）：800-804.

[3]Carrillo C，Tulman E，Del H G，et al.Comparative genomics of foot-and-mouth disease[J].Virus，2005，79（10）：6487-6504.

[4]尤永进，葛 艳，陈 波，等.口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达 [J].中国兽医学报，2004，24（1）：131-134.

[5]吴锦艳，刘湘涛，胡永浩，等.猪口蹄疫病毒对三种动物细胞噬性的研究[J].甘肃农业大学学报，2005，40（3）：306-310.