HPLC法测定吴茱萸碱分散片中吴茱萸碱的含有量及其均匀度

盛蓉，宋英，呼梅，陈佳，朱璐璐

(1.成都中医药大学附属医院，四川成都610072;2.成都中医药大学，四川成都610075)

吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.是临床常用中药，具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻之功效，用于寒滞肝脉诸通症［1］。吴茱萸含有多种化学物质，生物碱类是其主要生物活性成分，吴茱萸碱(Evodiamine)是吴茱萸生物碱类的代表成分［2］。课题组前期通过对我院治疗痛风性关节炎疗效较好的中药复方进行拆方、大类成分、单一成分的逐步筛选，从中优选出降尿酸作用较强的成分吴茱萸碱。已完成的药效学研究表明，吴茱萸碱具有降尿酸、抑制尿酸钠所致模型大鼠足肿胀、抗炎和镇痛的作用，其中降尿酸作用为首次发现［3］。但吴茱萸碱为难溶性药物，并且生物利用度偏低［4］，为提高其生物利用度及发挥其速释效果，将其制备成分散片。本实验采用高效液相色谱法(HPLC)，建立吴茱萸碱分散片中吴茱萸碱含有量和均匀度的测定方法，为制订该制剂的质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器HP1100型高效液相色谱仪(美国惠普)，四元泵，DAD检测器，HP化学工作站;依利特C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);BP211D型分析天平(德国赛多利斯);AS10200超声波清洗器(天津奥特赛斯仪器有限公司)。

1.2 试药吴茱萸碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110802-200606);吴茱萸碱分散片(自制，批号:120420、120421、120422);水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定量测定

2.1.1 色谱条件依利特-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL磷酸溶液含2 mL四氢呋喃)(38:62);体积流量:1 mL/min，检测波长:225 nm;柱温:30℃;进样量:5 μL。

2.1.2 溶液的制备

对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含34.5 μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取吴茱萸碱分散片20片，研细，取约0.05 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加适量甲醇超声45 min(功率:150 W，频率:33 kHz)，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

空白溶液的制备按吴茱萸碱分散片处方称取辅料适量，按吴茱萸碱分散片的制备工艺和供试品溶液的制备方法制成空白溶液。

2.1.3 专属性试验分别精密吸取上述对照品溶液、空白溶液和供试品溶液各5 μL，照2.1.1项下的色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，在与对照品溶液相同的保留时间，供试品溶液有相同的峰，而空白溶液无峰，说明辅料对主药的测定无干扰。理论塔板数按吴茱萸碱计算不低于3 000，分离度大于1.5，见图1。

2.1.4 标准曲线的制备精密吸取吴茱萸碱对照品溶液(0.034 5 mg/mL)0.5、1、3、5、10、15、20 μL分别进样，按2.1.1项下的色谱条件注入液相色谱仪，记录峰面积，以吴茱萸碱峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程:Y=10 239.641 7X+2.919 54(r=0.999 9)。结果表明，吴茱萸碱进样量在0.017 25～0.69 μg与峰面积呈良好的线性关系。

图1 吴茱萸碱对照品(A)、供试品(B)和空白溶液(C)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substance(A)，sam p le(B)and blank solution(C)

2.1.5 精密度试验精密吸取吴茱萸碱对照品溶液5 μL，按2.1.1项下的色谱条件连续进样6次，测定，结果吴茱萸碱峰面积的RSD为0.696%(n=6)，精密度良好。

2.1.6 稳定性试验取同一供试品(批号120420)溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样5 μL，按2.1.1项下的色谱条件测定，结果吴茱萸碱峰面积的RSD为0.373%(n=5)，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.1.7 重复性试验取吴茱萸碱分散片(批号120420)适量，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，精密量取5 μL，按2.1.1项下的色谱条件测定，计算吴茱萸碱质量分数。结果表明，样品中吴茱萸碱质量分数的RSD为0.49%(n=6)，表明分析方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验取同批吴茱萸碱分散片(批号120420)适量，研细，取约0.025 g，精密称定，共6份，分别精密加入吴茱萸碱对照品溶液(0.167 0 mg/mL)10 mL，按2.1.2项下供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 吴茱萸碱分散片加样回收率试验(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of evodiam ine(n=6)

结果平均回收率为98.45%，回收率在95%～105%之间，RSD值为1.40%，表明本法回收率良好。

2.2 样品测定取3批样品(批号120420、120421、120422)，每批3份，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果质量分数分别为97.13%、97.62%、97.89%，RSD值分别为0.65%、0.84%、0.32%。

2.3 含有量均匀度［5］取3批样品(批号120420、120421、120422)，每批10份，各取1片，精密称定，置100 mL量瓶中，加适量甲醇超声45 min(功率:150 W，频率:33 kHz)，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。按前述色谱条件分别测定含有量，结果见表2。

3 讨论

3.1 供试品提取溶剂的考察吴茱萸碱为常用中药吴茱萸中吲哚喹啉类生物碱的重要成分［6］，溶于丙酮，略微溶于乙醇、乙醚及三氯甲烷，几乎不溶于水、石油醚及苯，为难溶性药物。试验中分别考察了丙酮、乙腈、甲醇和乙醇［7］作为提取溶剂对吴茱萸碱分散片中吴茱萸碱含有量测定的影响，结果以甲醇、丙酮作为提取溶剂吴茱萸碱溶解性均较好，但以丙酮为溶剂在吴茱萸碱峰处有干扰，故选择甲醇为提取溶剂。

表2 吴茱萸碱分散片含有量均匀度(n=10)Tab.2 Results of content uniform ity of samples(n=10)

3.2 供试品提取时间的考察［8］分别考察超声时间5、10、20、30、45、60 min(功率:150 W，频率:33 kHz)对吴茱萸碱分散片中吴茱萸碱含有量测定的影响，结果超声提取45 min时吴茱萸碱提取率较高，且与60 min的提取率无显著性差异，所以超声提取45 min即可。

3.3 流动相的考察参考有关文献［9-12］及2010年版《中国药典》［1］，选用乙腈-0.1%磷酸(38∶62)与乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸(41∶59∶1∶0.2)为流动相，均达到满意的分离效果，吴茱萸碱峰基线分离，峰形对称;但乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸(41∶59∶1∶0.2)作为流动相时，吴茱萸碱峰保留时间太短，与溶剂峰出峰时间相隔太近，为避免溶剂峰的干扰，因此选择乙腈-0.1%磷酸(38∶62)(每100 mL磷酸溶液含2 mL四氢呋喃)为流动相，分离效果较佳。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:160.

［2］唐元清，冯孝章，黄量，等.吴茱萸化学成分的研究［J］.药学学报，1996，31(2):151-155.

［3］宋英，盛蓉，李涓，等.吴茱萸碱治疗痛风的药效学研究［J］.中药药理与临床，2011，27(6):17-19.

［4］Shyr M H，Lin L C，Lin T Y，et al.Determination and pharmacokinetics of evodiamine in the plasma and feces of conscious rats［J］.Analytica Chimica Acta，2006，558(1/2):16-21.

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