葛根素脂质体包封率测定及制备工艺优化*

郭 莹李 莎

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江工业大学，浙江 杭州 310000）

葛根素具有防止血小板聚集、抗血栓［1］、改善血流［2］等作用，但其水溶性和脂溶性较差，生物利用度低，体内消除半衰期较短，需频繁给药［3］，限制了其应用。研究表明，脂质体对缺血心肌组织和细胞具有被动靶向作用［4］。将药物包封于脂质体中可改善药物体内的脂水分配系数，延缓药物释放，减少用药剂量，提高生物利用度［5-6］。本实验采用薄膜分散法制备葛根素脂质体，建立包封率的测定方法，并采用正交试验优化葛根素脂质体的制备工艺，为葛根素脂质体的研究提供基础。

1 材 料

752型紫外-可见分光光度计 （上海菁华科技仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）；SPS-2001型电子天平（上海海康电子仪器厂）；葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110752-200209）；大豆卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司，批号：W20100601）、胆固醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080903）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯，湖州湖试化学试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，安徽安特生物化学有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；氯仿（分析纯，浙江迪耳药业有限公司）。

2 方法与结果

2.1 葛根素脂质体的制备

采用薄膜分散法制备：称取处方量的大豆卵磷脂，胆固醇，溶于10mL氯仿，形成澄明溶液，置于茄型瓶中，38℃水浴旋转蒸发除去有机溶剂，至瓶壁上形成均匀透明的薄膜。另取处方量的葛根素溶于20mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH＝7），加入上述附有薄膜的茄型瓶中，搅拌使薄膜溶解，形成混悬液，即得葛根素脂质体。上述葛根素磷酸盐缓冲液中不加葛根素，同法操作即可制得空白脂质体。

2.2 葛根素脂质体包封率测定方法的建立

2.2.1 检测波长的选择 精密称取葛根素对照品适量，用无水乙醇配成20μg/mL的溶液，以无水乙醇为空白溶液，在200～500nm的波长范围内进行光谱扫描，见图1。同法对空白脂质体的乙醇溶液扫描，见图1。结果葛根素在250nm波长处有最大吸收，而空白脂质体在此波长无吸收，故确定用250nm波长作为葛根素脂质体的检测波长。

图1 光谱扫描图

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取葛根素10mg，置于100mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL的容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L 的溶液。以70%乙醇为空白溶液，用紫外分光光度计在250nm波长处测定葛根素溶液的吸光度，以质量浓度C（mg/L）为横坐标，吸光度A为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，得y=0.0835x+0.0008，r=0.9998。

2.2.3 日内与日间精密度实验 取低、中、高3种质量浓度（2.0、6.0、10.0mg/mL）葛根素乙醇溶液，1d 内连续 5 次测定吸光度，考察其日内精密度；连续测5d（每日1次）测定吸光度，考察其日间精密度。结果表明，用紫外分光光度法测定葛根素浓度精密度良好。

表1 日内精密度

表2 日间精密度

2.2.4 葛根素游离药物的回收率实验 见表3。精密量取0.5mL空白脂质体溶液，分别加入低、中、高3种质量浓度（2.0、6.0、10.0mg/mL）的葛根素乙醇溶液，用乙醇定容至25mL，测定吸光度，根据回归方程计算葛根素实际质量浓度，计算回收率。结果表明游离药物的回收率符合要求。

表3 游离药物回收率

2.2.5 空白脂质体的干扰实验 精密移取空白脂质体2mL，置于透析袋中，将透析袋置于250mL烧杯中，加入200mL PBS（pH=7），不断搅拌，分别于 8、12、18、24h 取少量透析外液，用甲醇适当稀释后250nm处测定吸光度，测得吸光度值为0，基本确定在24h内脂质体没有泄露，对包封率的测定没有干扰。

2.3 葛根素脂质体的处方优化 以包封率为指标，选取3个主要影响因素：磷脂与胆固醇质量比（A）、葛根素与磷脂质量比（B），葛根素在PBS中的质量浓度（C），每个因素取3个水平，进行正交试验，试验结果见表4，方差分析见表5。根据直观分析结果：影响葛根素脂质体包封率的各因素的主次关系依次为：B＞C＞A，且均为显著性因素，由此得出的最优搭配为：A2B2C1。故确定处方为大豆卵磷脂60mg，胆固醇30mg，溶于10mL氯仿中，作为有机相；5mg葛根素溶于20mL PBS中作为水相。结果制得的脂质体包封率为64.7%。

表 4 L9（34）正交试验结果

表5 方差分析

2.4 初步稳定性实验

将脂质体溶液分别置于冰箱 （4℃）、 室温 （25℃）、40℃和60℃环境下，于1、2、3个月取样观测，以脂质体外观和包封率为指标初步考察葛根素脂质体的稳定性。结果见表6，表7。结果表明制剂在4℃和25℃环境下，3个月内外观和包封率无明显变化。40℃环境下，第2个月开始包封率有所下降。60℃时，第1个月包封率即明显下降，制剂也开始发黄变黏。因此，制剂应尽量低温保存。

表6 不同温度下时间对脂质体外观的影响

表7 不同温度下时间对脂质体包封率的影响（%）

3 讨 论

脂质体的制备方法有许多种，如薄膜分散法、注入法、冷冻干燥法、硫酸铵梯度法等。薄膜分散法是研究最早，最简单，现在也经常使用的一种制备方法。通过查找文献和预实验发现完全可以满足葛根素脂质体的制备，故本实验决定采取该法进行脂质体的制备。

包封率测定的关键是将未包封的游离药物与脂质体分离，各种分离方法各有利弊。超滤离心所用的离心管一般是一次性的，成本较高。微柱离心法和葡聚糖凝胶柱法虽效果较好，但操作复杂，成本也较高。而透析法虽所需时间较长，但是操作简便，所用的透析袋价格便宜，用量较少，并可重复使用，比较经济，所以本实验决定采用透析法进行游离药物的分离。实验中所建立的包封率的测定方法稳定可靠、且空白脂质体对浓度测定无影响。

正交设计优化葛根素脂质体的制备处方，根据实验结果确定最优处方为：大豆卵磷脂∶胆固醇＝2∶1（m∶m），大豆卵磷脂∶葛根素＝12∶1（m∶m），葛根素脂质体包封率为 64.7%。初步稳定性实验结果表明，制剂在4℃和25℃环境下，3个月内外观和包封率无明显变化；40℃环境下，第2个月开始包封率有所下降；60℃时，第1个月包封率即明显下降，制剂也开始发黄变黏。因此，制剂应尽量低温保存。

该项研究可为如何提高葛根素的生物利用度和体内靶向作用提供一定的实验基础和理论依据，为该制剂的开发提供借鉴。

［1］石瑞丽，张建军.葛根素对缺氧性血管内皮细胞凋亡的保护作用［J］.药学学报，2003，38（2）：103-107.

［2］刘健民，马莉，何伟平.葛根素治疗突发性聋的疗效观察［J］.第一军医大学学报，2002，22（11）：1044-1045.

［3］吴燕红，苏子仁，陈建南，等.从小鼠体内血药浓度时间曲线与组织分布特征评价葛根素的给药途径［J］.中药新药与临床药理，2005，16（2）：112-115.

［4］张灵芝，唐朝枢.脂质体药物载体靶向治疗心血管病［J］.医学研究杂志，2001，30（2）：15-16.

［5］黄义昆.脂质体作为药物载体研究进展［J］.中国药师，2005，8（7）：549-550.

［6］郑宁，张立德.脂质体质量控制方法的研究概况［J］.中国新药杂志，2004，13（12）：1282-1286.