快速溶剂萃取-离子色谱法测定茶叶中的有机酸

章剑扬 ，刘新 ，车金水 ，汪琼 ，陈艳 ，叶明立

（1.中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008； 2.赛默飞世尔有限公司上海实验室，上海 201203；3.浙江省环境保护科学设计研究院，杭州 310007）

快速溶剂萃取-离子色谱法测定茶叶中的有机酸

章剑扬1，刘新1，车金水2，汪琼2，陈艳3，叶明立2

（1.中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008； 2.赛默飞世尔有限公司上海实验室，上海 201203；3.浙江省环境保护科学设计研究院，杭州 310007）

建立了快速溶剂萃取-离子色谱法（ASE-IC）测定茶叶中的9种有机酸。优化了ASE萃取条件，以水为萃取溶剂，80℃下萃取5 m in，循环两次。采用Ionpac AS11 HC柱分离，KOH溶液梯度洗脱，流速1.0m L/m in，抑制电导检测。9 种有机酸的检出限为 0.009～0.160μg/m L，线性范围为 0.5～10μg/m L，相关系数大于 0.999，加标回收率为 93.4%～99.2%，相对标准偏差为 1.4%～4.1%。

快速溶剂萃取；离子色谱；有机酸；茶叶

茶叶中有机酸的种类较多，有机酸是茶叶香气和滋味的主要成分之一，并且参与茶树的新陈代谢，在生化反应中常为糖类分解的中间产物［1-3］。此外，某些有机酸对茶多酚激活-淀粉酶、胰蛋白酶酶活性具有协同效应。因此对茶叶中有机酸的定性、定量分析在茶叶生产管理过程中必不可少［1-3］，而且对茶叶品质开发具有重要意义。

目前对茶叶中有机酸的提取主要采用浸泡法、回流法和超声提取法。但这些方法的萃取效率较低，且样品之间的误差较大。加速溶剂萃取技术（Accelerated Solvent Extraction，ASE）是在较高的温度和压力下用溶剂萃取固体或半固体样品前处理方法。在高温高压条件下，待测物从基体上的解吸和溶解动力学过程加快，可大大缩短提取时间，减少溶剂的用量，同时提高对目标产物的提取率［4］。目前，有机酸常用比色法、分光光度法、HPLC-UV/RI等方法分析，但这些方法存在一定的缺陷，分光光度法需要预分离，衍生化等繁琐处理，而且灵敏度较低；HPLC-UV/RI对含碳的有机酸专属性和灵敏度不够［5,6］。采用离子色谱在抑制电导模式下分离检测有机酸，可以得到较低的检出限及很好的重现性，而且步骤简单。

笔者优化了快速溶剂萃取和离子色谱条件，采用快速溶剂萃取（ASE）-离子色谱（IC）法测定茶叶中9种常见的有机酸，得到了满意的结果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

快速溶剂萃取仪：Dionex ASE350型，美国戴安公司；

离子色谱仪：Dionex ICS-5000型，配电导检测器，Chromeleon6.8色谱工作站，Dionex EG淋洗液发生器，美国戴安公司；

抑制器：ASRS 300（4 mm），美国戴安公司；

尼龙滤膜过滤头：0.22 μm ；

甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸、戊酸、己酸、草酸、苹果酸和柠檬酸标准品：阿拉丁试剂有限公司；

氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子和磷酸根离子溶液：上海市测量技术研究院；

实验用水为18.2 MΩ·cm的二次去离子水。

1.2 ASE萃取条件

将茶叶粉碎至550μm(30目)左右，过筛。精密称取0.5 g粉碎后的样品，与石英砂混匀，倒入垫有玻璃纤维素膜的不锈钢萃取池中，在设定的萃取条件下（表1）用水进行ASE萃取。将萃取液定容至25 m L，然后过0.22 μm滤膜过滤头，待离子色谱分析。

表1 ASE萃取条件

1.3 色谱条件

色谱柱：Dionex IonPac AS11 HC （50mm×4 mm）保护柱，Dionex IonPac AS11 HC （50mm×4 mm）分析柱；淋洗液为发生器产生的高纯KOH溶液，流速为1 m L/min，梯度淋洗：0～15 min, 浓度为0.8 mmol/L ；15～30m in，浓度为 0.8～12 mmol/L ；30～45 m in，浓度为12～38 mmol/L ；45～50min，浓度为38～50mmol/L ；ASRS-300抑制器，电化学自再生抑制模式；进样量：25 μL；电导检测器检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

IonPac AS11 HC色谱柱在测定实际样品中的有机酸方面具有较大的优势，在KOH溶液梯度淋洗条件下，能够同时分离几十种常见的无机阴离子和有机酸。针对茶叶样品中存在的有机酸种类，优化了KOH溶液淋洗条件，低浓度KOH溶液能使F-、乳酸和乙酸得到较好的分离。考察了不同的梯度条件对戊酸、己酸、苹果酸、草酸等分离的影响，选择了最优的色谱条件。在此条件下茶叶中常见的有机酸得到了很好的分离，F-，Cl-，，和均对9种有机酸无干扰。图1、图2分别为加入F-，Cl-等干扰后有机酸标准样品和茶叶样品的离子色谱图。

图1 9种有机酸标准样品离子色谱图

图2 茶叶样品离子色谱图

2.2 ASE条件选择

2.2.1 萃取溶剂

有机酸极性较强，据文献报道常采用极性较强的溶剂（如水、甲醇、乙醇等）进行提取。实验分别采用水、甲醇、乙醇作为萃取剂，对茶叶中的有机酸进行萃取。结果表明，采用水作为提取液时，对各种有机酸的萃取效果较好，且有机酸色谱峰峰形良好，无杂质干扰。

2.2.2 萃取温度

温度是影响萃取效率的最重要的参数之一。实验考察了 4种不同温度（60，80，100，120℃）对 9种有机酸提取率的影响。结果表明，80℃时，9种有机酸的提取效果最佳，加标回收率为93.4%～99.2%。

2.2.3 静态萃取时间和循环次数

以5 m in为静态萃取时间，考察循环次数对9种有机酸萃取率的影响，对同一样品进行3次单循环萃取。结果表明，2次萃取循环能够完全萃取茶叶中的有机酸，5 m in静态萃取时间较为合适。

2.3 工作曲线和检出限

将1 000μg/m L 有机酸混合标准溶液逐级稀释，配制成 0.50，1.0，2.0，5.0，10.0μg/m L 的系列有机酸混合标准工作溶液，在1.3色谱条件下进行测定。以峰面积Y对有机酸质量浓度X（μg/m L）进行线性回归。9种有机酸的线性关系良好，r2均大于0.999。在1.3条件下，以信噪比等于3计算检出限，9 种有机酸的检出限范围为 0.009～0.160μg/m L，线性回归方程及检出限见表2。

表2 工作曲线方程及检出限

2.4 回收率和精密度试验

称取0.5 g茶叶样品3份，加入混合标样，以ASE提取，进行离子色谱分析，结果见表3。9种有机酸的加标回收率为93.4%～99.2%，相对标准偏差为1.4%～4.1%。由此可见，该方法的精密度和准确度较高。

表3 加标回收率及精密度试验结果

2.3 ASE提取与回流提取、超声波提取的比较

回流提取和超声波提取为提取有机酸的传统方法，实验对ASE提取、回流提取和超声波提取进行了比较。回流提取：称取0.5 g样品，加入100m L水，于沸水浴中回流提取2 h，过滤，定容，过0.45 μm过滤膜，待IC分析。超声提取：称取0.5 g样品，加入50m L水中，于超声波清洗仪上超声提取1 h，过滤，定容，过0.45μm过滤膜，待IC分析。实验结果表明，回流提取和超声提取对各种有机酸的提取效率接近，但平行样品之间测定结果的相对标准偏差（3.7%～8.2%）波动较大；ASE对有机酸的提取率高于回流提取及超声提取10%左右，且稳定性更好，测定结果的相对标准偏差为1.4%～4.1%。

2.4 样品测定

选取5种不同茶叶的样品，按1.2萃取条件进行萃取，在1.3色谱条件进行测定，实验结果列于表4。

表4 茶叶样品中9种有机酸测定结果 mg/g

3 结语

采用ASE对茶叶中的9种有机酸进行提取，然后采用IC进行分离分析，用电导检测法检测，该方法操作简单、快速，重现性好、回收率高，可用于茶叶样品中有机酸的快速测定，并且具有较高的实用价值。

［1］谭和平，叶善蓉，陈丽，等.茶叶中有机酸的测试方法概述［J］.中国测试技术，2008，34(6):77-80.

［2］丁玲，屠幼英，陈晓敏.高效液相色谱测定紧压茶中有机酸条件研究［J］.茶叶，2005，31(4):224-227.

［3］张光军，许建文，丁明玉.离子交换色谱法同时分析绿茶中有机酸和无机阴离子的含量［J］.新乡医学院学报，2002，19(1)：36-38.

［4］刘静.戴安公司ASE 快速溶剂萃取技术-解决您化学实验样品前处理的最新技术［J］.检验检疫科学，2003，13(2):58.

［5］吴飞燕，贾之慎，朱岩.离子色谱电导法测定酒中的有机酸和无机阴离子 [J].浙江大学学报，2006，33(3):312-315.

［6］傅彤，刘庆生，范志影,等.应用离子色谱测定青贮饲料中有机酸含量的研究［J］.中国畜牧兽医，2005，21(5):16-17.

Determ ination of Organic Acid in Tea by Accelerated Solvent Extraction-Ion Chromatography

Zhang Jianyang1，Liu Xin1, Che Jinshui2，Wang Qiong2，Chen Yan3，Ye M ingli2
(1.Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2.Shanghai Lab, Thermofi sher Scientifi c,Shanghai 201203, China; 3.Environmental Science Research and Design Institute of Zhejiang Province, Hangzhou 310007，China)

A method was developed for the determ ination of nine organic acids (OA) in tea by accelerated solvent extraction-ion chromatography (ASE-IC). The ASE extraction conditions were optimized. The tea samples were extracted at 80℃，for 5 min and two extraction cycles using water as extractant. The Dionex Ionpac AS11 HC was employed as analytical column，KOH solution as the gradient elution at a fl ow rate of 1.0m L/min，and a suppressed conductive detector as the detector. The method obtained good linearity in the range of 0.5-10μg/m L for organic acids w ith relative coeffi cient more than 0.999. The detection lim its were 0.009-0.160μg/m L (S/N=3), the recoveries of the standard addition experiment ranged from 93.4%-99.2%，and the relative standard deviation ranged from 1.4% to 4.1%.

accelerated solvent extraction; ion chromatography; organic acid; tea

文献标识码：A 文章编号：1008-6145(2012)01-0043-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.013

联系人：车金水；E-mail:chejinshui@hotmail.com

2011-12-02