同位素稀释气相色谱串联质谱法测定海产品中的苯并(a)芘的残留量*

王建华 ，宫萍 ，田良良 ，王兴华 ，杨君 ，王境堂

（1.山东出人境检验检疫局食品农产品检测中心，山东青岛 266002； 2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 3.青岛大学，山东青岛 266071）

同位素稀释气相色谱串联质谱法测定海产品中的苯并(a)芘的残留量*

王建华1，宫萍1，田良良2，王兴华1，杨君3，王境堂1

（1.山东出人境检验检疫局食品农产品检测中心，山东青岛 266002； 2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 3.青岛大学，山东青岛 266071）

采用同位素稀释法结合固相萃取净化，建立了海产品中苯并(a)芘残留的气相色谱串联质谱(GC-MS／MS)检测方法。样品经乙腈-丙酮（体积比6∶4）溶液提取，硅胶固相萃取净化，苯并(a)芘用GC-MS／MS测定，同位素D12-苯并芘内标法定量。方法的平均回收率为93%～98%，相对标准偏差为6.2%～12.2%(n=6)，定量限为0.2μg／kg。用该方法测定FAPAS烟熏鱼有证标准样品，测定值与标准值一致。

气相色谱-串联质谱；苯并(a)芘；海产品；同位素稀释

多环芳烃是一类环境污染物，通过环境介质进入生物体内［1］，其中苯并(a)芘(BAP)是其中的代表物质，许多国家或地区对其有严格的限量规定。2011年6月中国渤海中南部海域的蓬莱19-3油气田发生漏油事件后，引起国内外的高度关注。石油中含有苯并(a)芘，为此，7月韩国农林水产省向各检验检疫所紧急下达了蛤蜊、安康鱼、章鱼、梭子蟹等中国进口的此水域水产品中苯并(a)芘的检测计划，并且通报中国，因此，我国亟需开展常规检测方法研究。韩国的标准中鱼类苯并(a)芘含量需低于2.0 μg／kg，蛤蜊需低于 10.0 μg／kg，软体和甲壳类需低于5.0 μg／kg。对于水产品中苯并(a)芘，欧盟指令1881／2006 EC规定限量分别为2 μg／kg，烟熏水产品为 5 μg／kg［2］，中国 GB 2762-2005《食品污染物限量》规定的限量为10.0 μg／kg。

有关水（海）产品中苯并(a)芘或多环芳烃测定方法主要有高效液相色谱荧光法［3-5］，气相色谱-质谱法［6-9］，气相色谱-高分辨质谱法［10］。

笔者通过条件优化后选择乙腈-丙酮溶液提取海产品中苯并(a)芘，硅胶柱净化；采用GC-MS／MS测定保证了定性结果的可靠性并提高了灵敏度；通过添加同位素到样品中作为分析质量控制和定量测定的手段，保证了定量结果的可靠性。应用于FAPAS烟熏鱼有证标准样品测定，测定值与标准值一致。该方法简便、快速，准确,已用于海产品中苯并(a)芘常规检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

三重四级杆气相色谱质谱仪：TSQ QuantumGC型，带电子轰击电离源（EI），美国 Thermofisher公司；

水平震荡器：HS501型，德国IKA公司；

旋转蒸发仪：BUCHI R-200型，瑞士Buchi公司；

苯并(a)芘标准溶液：1 mg／mL，0～4℃避光保存，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

D12-苯并芘：纯度大于99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

硅胶固相萃取柱：agela cleanert silica-SPE(1000 mg，6 mL)，天津博纳艾杰尔公司；

乙腈、丙酮、环己烷：HPLC级；

氯化钠：分析纯。

1.2 GC-MS／MS分析条件

（1）色谱条件

色 谱 柱：HP-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；温度程序：70℃（2 min），以25℃／min升温至140℃，以10℃／min升温至240℃，然后再以5℃／min升温至300℃（5 min）；载气：He，纯度不小于99.999%，流速为1 mL／min；进样口温度：270℃。

（2）质谱条件

传输线温度：280℃；离子源温度：250℃，Q2碰撞气：氩气；无分流进样，1 min后打开分流阀；进样量：1.0 μL；离子化模式：CEI，正离子扫描；检测方式：选择反应监测（SRM）；溶剂延迟：5 min。

1.3 实验方法

将海产品去壳，去骨，取可食用的部分绞碎均匀。称取4 g绞碎后的样品，加入400 μL内标D12-苯并芘，加入20 mL乙腈-丙酮（体积比6∶4）均质 2 min，用10 mL乙腈-丙酮（体积比6∶4）清洗均质机后合并入相应的提取离心管中，震荡10 min，加入过量的氯化钠，以5 000 r／min离心10 min，将15 mL上清转移入干净的离心管中，-70℃静置20 min，将上清转移入梨形瓶，40℃水浴旋转蒸发至近干，氮气吹干，以2 mL环己烷溶解。

Silica SPE柱预先用5 mL环己烷活化，将样品过柱，收集过柱液，梨形瓶中加入5 mL环己烷清洗过SPE柱，另外用15 mL环己烷淋洗SPE柱，合并所有过柱液，40℃水浴旋转蒸发至近干，氮气吹干，用1 mL环己烷定容，转移入样品瓶，供GC-MS／MS测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理优化

水产品中样品前处理方法包括：皂化后，正己烷或环己烷提取，硅胶或 florisil固相萃取柱净化［3-5，8］；章汝平等［9］采用正己烷-二氯甲烷索氏提取后，硅胶净化；Jalal Hassan etal［7］采用乙腈均质提取，GPC 净化。

文献［11］选择用乙腈-丙酮(60∶40)混合溶液作为溶剂均质提取。经过实验，选择硅胶固相萃取柱作为净化柱，环己烷为洗脱剂。净化前盐渍蛤蜊提取液呈深黄色，净化后定容溶液呈淡黄色。

2.2 质谱条件优化

GC-MS／MS在SRM检测模式下具有很好的选择性和专属性，已经用于农残等的分析［13］。质谱条件优化首先用进标准溶液进行全扫描分析，获得保留时间[苯并(a)芘22.62 min，D12-苯并芘22.54 min]和一级质谱图，选择其中丰度比高的母离子做子离子扫描，得到二级质谱。苯并(a)芘和D12-苯并芘，在全离子扫描模式下分别得到丰度最高的分子离子m／z252、264，对其进行子离子扫描，按照欧盟指令［13］，对于 GC-MS／MS，一个母离子，2个子离子4个识别点满足定性要求，监测离子对及丰度比：m／z252／250(100)、m／z252／226(6.5)，同位素D12-苯并芘得到离子对：m／z264／260(100)、m／z260／232(23)，260／236(3)，优化后的碰撞能量为40，获得m／z较大且丰度最大的子离子对252／250和264／260为定量离子对。各离子对驻留时间均为 100 ms。改变扫描宽度（m／z）0.02，0.05，1.00，根据信噪比选择0.02最佳。改变扫描时间分别为0.02，0.05，0.08，1 s，信噪比逐渐增大，考虑到峰形，选择最佳扫描时间为0.08 s。

2.3 方法学的参数

GC-MS／MS法：分别配制浓度为0.2～20 ng／mL 9个水平的苯并(a)芘和等浓度的D12-苯并芘标准溶液，进样测定。以苯并(a)芘与内标的定量离子对色谱峰面积比(Y)为纵坐标，标准溶液浓度（X)为横坐标进行线性回归。苯并(a)芘在相当于0.1～10 µg／kg范围内符合线性关系，线性方程为Y=0.418X-0.052 3，相关系数r2=0.999。进样0.4 ng

／mL(0.2 μg／kg)时，信噪比S／N大于 10，规定GC-MS／MS法的定量限(LOQ)为0.2 μg／kg。

采用本方法对章鱼、蛤蜊和安康鱼阴性样品中苯并(a)芘添加两水平进行6次分析，内标法定量。方法的回收率和相对标准偏差见表1。

表1 回收率和精密度试验结果（n=6）

2.4 实际样品检测

为了进一步验证方法的准确度，采用用本方法对在有效期内的FAPAS烟熏鱼酱T0642有证标准样品［14］进行了检测，测定结果见表2。由表2可以看出，测定值与标准值一致，进一步证明所建立的方法可靠。

表2 FAPAS 样品的分析结果

3 结语

采用SPE结合GC-MS／MS检测海产品中苯并(a)芘，灵敏度和准确度满足残留检测的要求，可以用于不同种类的海产品中苯并(a)芘检测。

［1］赵文昌，程金平，谢海，等.环境中多环芳烃(PAHs)的来源与监测分析方法［J］.环境科学与技术，2006，29(3): 105-107.

［2］COMMISSION REGULATION (EC)No 1881／2006 of 19 December 2006 Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs［S］.

［3］SC／T 3041-2008 水产品中苯并(a)芘的测定 高效液相色谱法［S］.

［4］黄鸾玉，黎小正，秦振发.固相萃取／高效液相色谱荧光法测定水产品中苯并(a)芘［J］.分析试验室，2009，28(12): 63-65.

［5］Pena T，Pensado L，Casais C，et al. Optimization of a microwaveassisted extraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons from fish samples［J］.J Chromatogr A，2006，1121(2): 163-169

［6］Ramalhosa M J，Paíga P，Morais S，et al. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish: evaluation of a quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe extraction method［J］.J Sep Sci，2009，32: 3 529-3 538.

［7］Jalal Hassan，Abolfazl Farahani. GC-MS determination of PAHs in fish samples following salting-out-assisted solvent extractiongel permeation chromatography［J］.Chromatographia，2011，74:477-482.

［8］杨家锋，钟惠英，段青源.气相色谱-质谱联用法测定水产品中 16种多环芳烃［J］.中国卫生检验杂志，2009，19(10):2 291-2 295.

［9］章汝平，郭萍，李锦辉.气相色谱-质谱法测定肉松、鱼干中的多环芳烃［J］.食品科技，2008，(6): 213-217.

［10］汤桦，陈大舟，吴雪，等.同位素稀释高分辨质谱法测定鱼组织中6种多环芳烃［J］.质谱学报，2010，31(4): 208-213.

［11］王建华，郭翠，庞国芳，等.GPC净化-同位素稀释内标定量GC-MS对植物油中多环芳烃的测定［J］.分析测试学报，2009，28(3): 267-271.

［12］李南，石志红，庞国芳，等.坚果中185种农药残留的气相色谱-串联质谱法测定［J］.分析测试学报，2011，30(5): 513-521.

［13］2002／657／(EC): EU Commission decision of 12 August 2002 implementing council directive 96／23／EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results(Text with EEA relevance)(notified under document number C(2002)3044).Official Journal of the European Communities L 221，17／08／2002.

Determination of Benzo(a)pyrene in Seafood by Gas Chromatography Tandem Mass Spectrometry with Isotope Dilution

Wang JianHua1， Gong Ping1， Tian Liangliang2， Wang Xinghua1, Yang Jun3， Wang Jingtang
(1. Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao 266002， China ； 2. Ocean University of China，Qingdao 266002， China；3. Qingdao University， Qingdao 266071， China)

An analytical method for the determination of Benzo(a)pyrene in seafood was developed by isotope dilution gas chromatography tandem mass spectrometry(GC-MS／MS). Sample was extracted by using acetonitrileacetone mixture as solvent，purged by silica solid phase extraction column and analyzed by GC-MS／MS under selective reaction monitoring mode. Three deuterated surrogate standards Benzo(a)pyrene-D12 were used as internal standards for quantification and analytical quality control. The limit of quantification(LOQs) was 0.2 μg／kg，the recoveries ranged from 93% to 98%， and the relative standard deviations were 6.2%-12.2%(n=6). The method was used to determine the quality control materials T0642 provided by the FAPAS and the results were consistent with standard values.

gas chromatography-tandem mass spectrometry; benzo(a)pyrene; seafood; isotope dilution

O657.7+1

A

1008-6145(2012)01-0024-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.007

*国家质检总局科技计划项目（2011IK222）

联系人：王建华；E-mail: whywrs@yahoo.com.cn

2011-11-08