化瘀散结片对实验性增生性玻璃体视网膜病变müller细胞胶原纤维酸性蛋白的影响

吴要华 叶河江 张晓婷 王文丽 卢艳平 严然 钟振东

增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是临床常见致盲眼病,其发病机制较为复杂,但大家公认PVR的发病机制主要是一个细胞介导的病理过程[1]。其基本病理过程主要表现为细胞的增生及增生膜的形成与收缩。其中细胞包括RPE、神经胶质细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等,以前的研究多集中在视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelial cells,RPE)细胞,而对另一关键细胞müller细胞研究较少涉及。müller细胞是视网膜中的主要神经胶质细胞[2],在视网膜的整个功能活动和病理生理中起着重要作用[3]。有文献[4]提到视网膜损伤后早期müller细胞即出现反应性胶质化。但müller细胞发生反应性改变的分子机制及信号传导以及对视网膜功能影响的机制并不清楚。而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是müller细胞的主要构成部分。故我们研究兔眼发生增生性玻璃体视网膜病变后müller细胞GFAP表达的变化,以探讨GFAP免疫反应变化在müller细胞反性应胶质化中的作用,为进一步研究müller细胞在PVR中的作用及机制打下基础。

1 材料与方法

1.1材料

实验动物:青紫蓝兔54只,体重1.5～3.0kg不等,雌雄不限(裂隙灯及检眼镜检查以排除外眼及眼底疾病),许可证:SCXK(川)2008-14,由四川省实验动物专业委员会养殖场提供。化瘀散结片:由水蛭、三棱、山楂、昆布、海藻等中草药按现代制剂制备工艺制成,西安碑林药业股份有限公司生产,临用时用三蒸水按照所需浓度进行稀释。使用时研成粉末,三蒸水混合,配制成混悬液。道诺霉素,意大利生产,购自SIGMA公司,批号:010M1117V。临用前无菌生理盐水配制成0.05mg/ml溶液。GFAP一抗、S- P免疫组化染色超敏试剂盒、DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1动物分组造模、给药及标本采集:54只成年健康青紫蓝兔随机分成6组,分别为正常组、阴性对照组、阳性对照组和化瘀散结片高、中、低剂量组,每组9只兔18只眼。除正常组外,其余5组兔参照朱丹[5]等的方法造成增生性玻璃体视网膜病变动物模型。造模前用氯霉素滴眼液滴双眼,3次/日共3天。术前用美多丽眼液散瞳直径约8mm,盐酸丙美卡因滴眼液角膜表面麻醉,3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射(1ml/kg)全身麻醉。将家兔的四肢固定,头部置于显微镜手术台上。充分暴露眼球。用一空针抽取事先备用的Dispase I液0.05ml于6点钟角膜缘后3～4 mm处穿透巩膜,进入玻璃体腔,当瞳孔区见到针尖抵达玻璃体中央时,将针尖斜面向上,缓慢注入,拔针后立即用棉签压迫针孔lmin左右以防止反流。术后双眼滴氯霉素滴眼液,3次/日共7天。共造模45只兔子。空白对照组9只兔子则向玻璃体腔注0.05ml无菌生理盐水,操作方法同上。造模后在有增殖条带出现时开始给药,正常对照组、模型对照组玻璃体腔注射无菌生理盐水0.1ml共一次,三蒸水(5ml/kg)连续灌胃28天,1次/日;阳性对照组玻璃体腔注射道诺霉素溶液(0.05g/ml)0.1ml共一次,三蒸水(5ml/kg)连续灌胃28天,1次/日;化瘀散结片高、中、低剂量组分别按1g /5ml /kg、0.5g /5ml /kg、0.25g /5ml /kg的浓度连续灌胃28天,1次/日。给药28天后处死动物,立即摘除眼球,各组随机选取9只眼球,4%多聚甲醛固定一周后取出眼球。

1.2.2观察指标与方法:石蜡切片经常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水后,采用S- P免疫组化法检测视网膜组织GFAP的表达。DAB显色,苏木素复染,脱水,透明、封片。阴性对照省去滴加GFAP一抗的步骤。用图像分析软件Motic Images Advanced计算IOD值(积分光密度),测量GFAP表达水平。

1.3统计学处理

2 结果

2.1增生性玻璃体视网膜病变后GFAP的表达免疫组化染色及OD值

正常对照组:兔眼视网膜内界膜下可见少许状棕色阳性GFAP着色,其余视网膜各层未见阳性GFAP着色(图1)。

模型对照组:在内界膜、外界膜和色素上皮层均充满了棕色阳性GFAP着色。视网膜全层结构模糊不整齐,各层细胞排列紊乱,细胞形态不清。

阳性对照组:在内界膜、视网膜神经纤维层、视网膜神经节细胞层、内从状层、内核层、外丛状层可见稀疏的垂直于视网膜长轴分布的线条状GFAP阳性着色,未延伸到外核层。视网膜全层结构清晰整齐,各层细胞排列整齐,细胞形态清晰。

高剂量治疗组:在内界膜、视网膜神经纤维层、视网膜神经节细胞层、内从状层、内核层可见稀疏的垂直于视网膜长轴分布的线条状GFAP阳性着色,未延伸到外丛状层。视网膜全层结构清晰整齐,各层细胞排列整齐,细胞形态清晰。

中剂量治疗组:在内界膜、视网膜神经纤维层、视网膜神经节细胞层、内从状层、内核层、外丛状层、外核层可见稀疏的垂直于视网膜长轴分布的线条状GFAP阳性着色,未延伸到外丛状层。视网膜全层结构清晰整齐,各层细胞排列整齐,细胞形态清晰。

低剂量治疗组:在视网膜各层可见垂直于视网膜长轴分布的线条状GFAP阳性着色,视网膜全层结构不甚清晰整齐,各层细胞排列不整齐,细胞形态不清。

图1 (黑色箭头表示棕褐色染色×200)

表1 各组GFAPIOD值的变化

注：与空白对照组比较:“△”P<0.05;“△△”P<0.01

与阴性对照组比较:“▲”P<0.05;“▲▲”P<0.01

“★”:阳性对组有一只动物的左眼并发眼内炎症,故未列入观察

“■”:中剂量治疗组一只动物在麻醉过程中死亡,一只动物的左眼并发眼内炎症

3 讨论

PVR是引起孔源性视网膜脱离手术失败和复发的最重要原因,在手术成功的病例中也可因PVR的存在影响患者视功能[6]。临床上孔源性视网膜脱离中PVR发生率约为5%～10%[7,8]。

Müller细胞是PVR增生膜中的重要成分[9],在PVR发发展过程中起着重要作用。有研究[10]提示与以往认识相比,müller细胞可能在PVR增生膜中发挥更加积极的作用,特别是在RPE细胞丰富的环境中刺激下。GFAP是构成胶质细胞支架的主要部分,由于其不与神经元及其突起、肌细胞、肌原纤维、成纤维细胞等发生免疫反应而有别于波形蛋白(vimentin)和结蛋白(desmin),常被作为胶质细胞的特征性标记物应用于免疫研究[11]。GFAP的表达增加水平,反映了Müller细胞分化增生的活跃程度。

中医学目前认为增生性玻璃体视网膜病变属于眼科血证中死血、干血的范畴,是眼科血证的晚期病症,其具体表现为在神膏内或视衣上形成有形之物,牵拉视衣,致视衣脱离。死血与干血分别出现于眼科血证的不同时期。临床上死血期多见于眼内出血后约45天到75天;而干血期则发生于出血后75天以上。其病机多为脾虚、肾虚或湿热等,导致阳气阴血不能充养于目,一方面视衣失于滋养或固摄;另一方面目失所养使病理产物蓄积(气滞、瘀血、水积、痰饮等)而成本病,故应以活血化瘀、软坚散结为其治疗大法。而化瘀散结片具活血化瘀、消积导滞、软坚散结之功。既往研究表明:化瘀散结片能提高源于双极细胞或müller细胞的b波波幅,缩短b波峰潜时,从而改善视网膜功能[12];同时化瘀散结片能抑制诱导神经胶质细胞增殖的血管细胞粘附分子(VCAM-1)的表达[13,14],进而抑制PVR的发展。本实验采用免疫组化半定量方法,发现模型对照组GFAP的IOD高于空白对照组,有极显著差异(P<0.01),提示造模成功;模型对照组GFAP的IOD值高于阳性对照组,有极显著差异(P<0.01);模型对照组GFAP的IOD值高于化瘀散结片高剂量治疗组、中剂量治疗组,有极显著差异(P<0.01),与低剂量治疗组比较无差异(P>0.05)表明化瘀散结片能减少GFAP表达水平,可抑制müller细胞增殖,减轻对视网膜的过度损伤反应,从而抑制PVR的进一步发展。

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