L－缬氨酸的发酵工艺条件研究

曾青兰，孙连连，王志勇

（咸宁职业技术学院 生物工程系，湖北 咸宁 437100）

L－缬氨酸是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能.在医药上，L－缬氨酸主要用于配制复合氨基酸制剂，特别是应用于配制高支链氨基酸输液及口服液.国内外大批量生产L－缬氨酸均采用微生物发酵法［1］.作者采用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CICC20887，在摇瓶条件下研究发酵工艺条件对L－缬氨酸产量的影响，以期为该菌工业化发酵生产L－缬氨酸奠定基础.

1 材料与方法

1.1 菌种

谷氨酸棒杆菌CICC20887，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心.

1.2 培养基配方

1.2.1 斜面培养基配方 葡萄糖：5.0g／L，NaCl：5.0g／L，牛肉膏：10.0g／L，蛋白胨：10.0g／L，酵母膏：5.0g／L，琼脂条：20.0g／L.用30% 的NaOH调pH＝7，0.1MPa灭菌20min［2］.

1.2.2 种子培养基配方 葡萄糖：25.0g／L，硫酸铵：5.0g／L，玉 米 浆：40.0g／L，豆饼水解液：2.5g／L，磷酸二氢钾：1.0g／L，硫酸镁：0.5g／L，硫酸亚铁：0.01g／L，硫酸锰：0.01g／L，轻质碳酸钙：10.0g／L，L－Met：0.3g／L，L－Ileu：0.2g／L，生物素（VH）：100 μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 的调pH＝7，灭菌条件0.1MPa灭菌20min［3］.

1.2.3 发酵培养基配方葡萄糖：70.0～120.0g／L，硫酸铵：40.0g／L，玉米浆：25.0g／L，磷酸二氢钾：1.0g／L，硫酸镁：0.5g／L，硫酸亚铁：0.01g／L，硫酸锰：0.01g／L，轻质碳酸钙：10.0g／L，生物素（VH）：20～100μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 调pH＝7，0.07MPa灭菌20min［2］.

1.3 发酵工艺条件的设定

采用单因素实验，设定不同发酵工艺条件进行摇瓶发酵，分析不同的发酵工艺条件对谷氨酸棒杆菌CICC20887产缬氨酸的影响.

1.4 L－缬氨酸测定方法

采用纸上层析法.

1.4.1 标准曲线的制定 精密称取缬氨酸标准品0.06g、0.14g、0.22g、0.30g、0.38g、0.46g，分别置于10ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀.分别吸取1μL于层析滤纸上，在层析液［V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（H2O）＝4∶1∶1］中展开，60℃烘干，用0.05%茚三酮－丙酮溶液喷湿，60℃烘干，显色［3］.剪下斑点放入10mL的 CuSO4－75%C2H5OH溶液洗脱，常温静置2h，直至斑点完全洗脱［4，6］.以洗脱剂作空白对照，在S22PC型分光光度计520nm处测定洗脱液的吸光度，以缬氨酸标含量作横坐标，以洗脱液的吸光度作纵坐标，用Excel软件处理，得缬氨酸标准曲线和回归方程.

1.4.2 发酵液中L－缬氨酸含量的测定 取发酵液高速离心（8 000r／min）2min，上清液置于4℃冷藏待测.根据发酵液中L－缬氨酸浓度确定样品稀释倍数.

取缬氨酸稀释发酵液1μL点样于层析滤纸上，照上法操作，测得吸光度，从标准曲线上换算出缬氨酸含量.

1.5 pH值测定方法

精密pH 试纸，pH：6.0～8.0或pH 计.

2 结果与讨论

2.1 初糖浓度对L－缬氨酸产量的影响

谷氨酸棒杆菌CICC20887在30℃，摇床转速为120r／min时，摇瓶发酵72h时，不同初糖浓度对L－缬氨酸产量的影响如图1.结果表明，发酵培养基中初糖浓度为90g／L时，发酵72h，L－缬氨酸的相对含量最高，过高或过低L－缬氨酸的相对含量明显下降.因为在发酵过程中，葡萄糖既为菌体生长提供所需的碳源，也为菌体合成L－缬氨酸提供所需碳的骨架，葡萄糖过低，限制了菌体的生长和L－缬氨酸的合成，但若过高，则会增加菌体外环境的渗透压，使发酵速度变慢，产酸率也会下降.

图1 初糖浓度对L－缬氨酸产量的影响Fig.1 Effect of concentration of initial glucose on the yield of L－valine

2.2 生物素对L－缬氨酸产量的影响

图2 生物素对L－缬氨酸产量的影响Fig.2 Effect of D－biotin on the yield of L－valine

谷氨酸棒杆菌为生物素（VH）需求型.生物素作为酶的辅助因子以多种方式参与细菌的代谢过程，因此，生物素的用量直接影响生产菌的细胞生长、增殖、代谢及细胞壁、细胞膜的通透性和产酸量的高低.在L－缬氨酸的生产中，生物素不足，代谢途径会向三羧酸循环方向发展，不利于L－缬氨酸的生成，因此，生物素要求相对过剩些.图2反映了生物素的不同添加量对L－缬氨酸产量的影响.结果表明，发酵培养基中生物素添加量为80μg／L时，摇瓶发酵72h，L－缬氨酸的相对含量最高.

2.3 VB1的不同添加量对L－缬氨酸产量的影响

图3反映了不同的VB1添加量对L－缬氨酸产量的影响.发酵培养基中VB1添加量为0.20mg／L时，摇瓶发酵72h，L－缬氨酸的相对含量最高，随着VB1添加量的增大，L－缬氨酸的相对含量明显下降，这可能是由于过量的VB1在菌体内转化成硫铵素焦磷酸（TPP），后者作为丙酮酸脱氢酶复合体系的辅助因子，促进了丙酮酸脱氢生成乙酰CoA进入TCA循环，从而减少了L－缬氨酸的合成.

2.4 玉米浆对L－缬氨酸产量的影响

玉米浆成分较为复杂，含氨基酸、生物素等多种营养因子，为谷氨酸棒杆菌生长与代谢提供了必要的营养成分，对菌体的生长有明显的促进作用.图4反映了不同的玉米浆添加量对L－缬氨酸产量的影响.结果表明，发酵培养基中玉米浆添加量为30g／L时，摇瓶发酵72h，L－缬氨酸的相对含量最高.

图3 VB1对L－缬氨酸产量的影响Fig.3 Effect of VB1on the yield of L－valine

图4 玉米浆对L－缬氨酸产量的影响Fig.4 Effect of corn syrup on the yield of L－valine

2.5 pH对L－缬氨酸产量的影响

本实验采用了2种pH值的形式：自然pH和前期（前24h）pH 值控制在6.5～6.7、中后期（后48h）控制在7.0～7.2.结果（图5）表明，后一种形式所获L－缬氨酸产量比未调pH的高出1倍多.

2.6 培养温度对L－缬氨酸产量的影响

温度是影响生物菌种的生长和产酸的一个基本物理因素.实验结果（图6）表明，该菌发酵产L－缬氨酸的适宜温度为30～31℃.

图5 pH对L－缬氨酸产量的影响Fig.5 Effect of pH on the yield of L－valine

图6 温度对L－缬氨酸产量的影响Fig.6 Effect of temperature on the yield of L－valine

2.7 培养时间对L－缬氨酸产量的影响

在上实验确定的适宜的发酵条件下进行摇瓶发酵，在发酵过程中每隔6h取样检测，结果如图7所示.从图中可以看出，谷氨酸棒杆菌CICC20887在24h即可检测到L－缬氨酸的存在，其产L－缬氨酸的高峰在66～72h，此为该菌的最佳发酵周期，此后发酵液中的L－缬氨酸量开始减弱.

3 结论

图7 培养时间对L－缬氨酸产量的影响Fig.7 Effect of incubating time on the yield of L－valine

谷氨酸棒杆菌CICC20887的发酵工艺条件研究表明，发酵生产L－缬氨酸的适宜初糖浓度为90g／L，添加生物素、玉米浆、VB1有利于L－缬氨酸的生产，其适宜添加量分别为80μg／L、30g／L、0.20mg／L，发酵期间，前24hpH 值应控制在6.5～6.7、后48h应控制在7.0～7.2，发酵适宜温度为30～31℃，发酵周期应控制在66～72h.次研究结果可为该菌工业化发酵生产L－缬氨酸提供基础.

［1］赵丽丽，陈 宁，熊明勇，等.低糖流加法生产L－缬氨酸发酵工艺条件的研究［J］.中国生物工程杂志，2003，23（1）：17－21.

［2］杨 毅，章志兰，姜绪林，等.生物素和 VB1在谷氨酸棒杆菌过量合成缬氨酸中的作用［J］.食品与生物技术学报，2005，24（4）：57－65.

［3］张伟国，钱 和.L－缬氨酸发酵条件的研究［J］.氨基酸和生物资源，2001，23（3）：28－31.

［4］曾祥群，周海滨.缬氨酸提取工艺研究［J］.发酵科技通讯，2001，30（1）：22～24.

［5］傅立明，张爱萍，温宝珍.氨基酸在纸层析中的分离［J］.山西医科大学学报，1998，29（4）：384.

［6］余 炜，伍时华，廖 兰，等.纸色谱法分离发酵液中L－亮氨酸的研究［J］.广西工学院学报，2003，14（4）：59－61.