根据cpDNAtrnT－trnF序列变异分析中国互花米草种群的遗传结构

吴娟子，王强，钟小仙，陈建群

（1.南京大学生命科学学院，江苏 南京210093；2.江苏省农业科学院畜牧所，江苏 南京210014）

互花米草（Spartinaalterniflora）是一种原产北美大西洋沿岸的禾本科米草属的多年生六倍体植物［1］，因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种［2，3］。1979年南京大学从美国东南部的北卡罗莱纳州、乔治亚和佛罗里达州引种的3种不同生态型互花米草种子及植株，首先被移栽至福建罗源，种子成熟后再经沿海各省滩涂多点引种，互花米草的种植取得了一定的生态和经济效益［4－6］。但作为外来入侵物种，其强大的繁殖能力和高大密集的种群特征，对我国沿海滩涂地区的生物多样性和水产养殖具有一系列不良影响，对生态系统造成了极大危害，2003年初，互花米草被环保总局列为我国第一批16种外来入侵物种名单［7］，互花米草的生物入侵问题越来越受到有关部门和研究者的关注，我国已有的研究主要关注互花米草的生物学特性、竞争性排斥、生态位替代、危害及控制技术等，对其入侵扩张的分子机制研究较少［7－9］，有关互花米草在我国地理种群内的遗传变异及其演化路径、入侵过程中的快速适应与进化机制等入侵扩张的分子机理有待进一步加强。

大量的研究表明，外来入侵种能在如此短的时间内迅速地作出适应性的进化，可能与其自身的遗传结构密切相关［10－12］。因此，对入侵物种种群遗传结构的研究将有助于理解其入侵进化机制。DNA分子作为遗传信息的直接载体不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，因此DNA分子标记技术和直接的DNA测序技术被广泛应用于揭示DNA序列差异，分析种群的遗传结构。应用较多的分子标记技术主要有RAPD（随机扩增多态性 DNAs，randomly amplified polymorphic DNAs）［13］、ISSR（简单重复序列间多态性，inter simple sequence repeat）［14］、SRAP（相关序列扩增多态性，sequence related amplified polymorphism）［15］和 AFLP标记（扩增片段长度多态性，amplified fragment length polymorphism）［9］等。同分子标记技术等指纹技术相比，DNA 测序能够提供最直接、最可靠的数据，且更易数字化，便于数据的分析、交流和检索。因此本研究将采用DNA直接测序的方法，研究我国互花米草种群的遗传结构。

一般来说，叶绿体基因组属于单亲遗传，并且结构简单、稳定，极少或者不发生重组和种内变异，但是叶绿体的一些基因间区序列进化速度较快，常用于植物的系统发育研究和遗传进化分析。trnT－trnF序列为植物叶绿体基因组的一段序列，由编码tRNA的trnT（UGU）3′外显子至trnL（UAA）基因的基因间区，trnL（UAA）内含子以及trnL（UAA）3′外显子至trnF（GAA）之间的基因间区组成，2段非编码区序列进化速率快，能提供较多的信息位点，多用于较低分类阶元及近期分化类群间系统发育和种间品种的鉴别研究［16］。也有研究表明该序列可用于某些类群种间甚至种下居群水平的研究［17］。早在1991年，Taberlet等［16］在这一位点上就设计了通用引物用于扩增这一序列，该序列在许多植物中均较易扩增，且序列质量较高。

本研究通过分析南起福建罗源，北至天津塘沽的8个互花米草种群的cpDNAtrnT－trnF的2段非编码区序列（trnT－trnL和trnL－trnF）的测序数据，初步研究了我国互花米草种群的遗传结构，旨在了解我国互花米草种群的遗传多样性结构，比较我国互花米草同原产地互花米草的遗传多样性差异，分析互花米草叶绿体基因的谱系来源，探讨互花米草种群遗传结构形成的相关因素。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2009年4－10月，沿纬度梯度选取我国东部沿海盐沼的8个互花米草种群（表1），每一种群随机选取约30株健康植株，植株间距大于50m，以尽可能避免重复采集同一克隆。将个体植株叶片采下后立刻放入事先准备好的装有约半袋硅胶的自封袋里，使叶片与硅胶充分混合，以便快速脱水。带回实验室后根据实际情况更换已经变色的硅胶，叶片干燥后，每一种群随机选取9～13个样本分别提取DNA。

表1 互花米草采样地点Table 1 Localities of S.alterniflora populations

1.2 DNA提取及PCR扩增

使用BioFlux公司的植物基因组DNA提取试剂盒（Biospin plant genomic DNA extraction Kit）从硅胶干燥的叶片中提取DNA。本研究使用Taberlet等［16］设计的通用引物对来自8个种群的80个样本的叶绿体trnT－trnL和trnL－trnF基因间区序列进行PCR（聚合酶链式反应，polymerase chain reaction）扩增和测序（2009年）。引物序列由上海生物工程技术有限公司生产合成（表2），其中PrimerA和PrimerB用于trnT－trnL区域的扩增和测序；PrimerC和PrimerF用于trnL－trnF区域的扩增，PrimerC、PrimerD和PrimerF用于该序列的测序。PCR扩增在Biometra Thermoblock T－1上完成，扩增反应体系为20μL，包括模板DNA（20～40ng／μL）1μL、Primer（10μmol／L）各0.8μL、10×LA PCR Buffer II（Mg2＋Free）2μL、dNTP Mixture（2.5mmol／L）3.2μL、MgCl2（25mmol／L）2 μL、TaKaRa LA Taq（5U／μL）0.2μL、ddH2O 10μL；扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后再72℃ 延伸5min，4℃ 保存。

1.3 目的片段的检测、纯化和序列测定

PCR扩增产物经0.8%琼脂糖电泳检测，确定为目的条带且无杂带干扰后使用上海捷倍思基因技术有限公司的PCR clea－up Kit直接清洁PCR产物，PCR产物浓度达到测序要求后，送至华大基因科技股份有限公司上海测序部直接双向测序。测序峰图明确、无杂峰的序列测序1次，对部分序列进行2～3次重复扩增、测序。

1.4 序列拼接、比对和分析数据处理

所得的序列用Sequencher 4.8进行拼接并根据峰图进行手工校正，然后利用Mega中的ClustalW模块进行对位排列。使用DnaSP 5.10计算单倍型多样性（Hd）、固定指数Fst和种群间基因分化系数Gst。固定指数Fst根据公式Fst＝1／（1＋2Nm）计算得出，式中，N是雌性有效种群大小，m是雌性迁移率［18］；种群间基因分化系数Gst根据公式Gst＝1／｛1＋4N［（m＋v）s／（s－1）］｝计算得出，式中，N是有效群体大小，m是每世代迁移率，s为亚群体的数目，v为每世代的突变速率［19］。使用GenAlEx6计算Nei遗传距离（D）及遗传一致度（I），分子方差分析（AMOVA）计算种群内、种群间的变异方差分布，并在MEGA上基于Nei遗传距离得到UPGMA聚类图。

表3 中国互花米草cpDNAtrnT－trnF单倍型Table 3 The variation sites of indel in cpDNA trnT－trnFsequence of S.alterniflora

2 结果与分析

2.1 中国互花米草叶绿体trnT－trnL 和trnL－trnF片段序列特点

经扩增、测序，部分样品重复扩增测序验证，利用PrimerA和PrimerB，共获得80条trnT－trnL基因间区序列，经序列比对，两端切平后，获得的序列绝对长度为772～773bp，平均核苷酸组成为：C 11.4%；T 33.1%；A 40.4%；G 15.1%，C＋G含量26.5%，在这一组序列中，没有发现核苷酸多态性位点，只发现了2个单碱基A的插入／缺失（indel）位点（单个核苷酸的插入／缺失算一次indel事件），分别在序列140和525 bp位置上。在中国种群内，利用PrimerC和PrimerD扩增得到的trnL－trnF序列中未发现多态性位点，经排序后，两端切平，得到1 004bp的整齐序列，序列碱基组成为 A：34.4%，G：17.0%，C：17.2%，T：31.4%，G＋C含量：34.2%。将测序所得的trnT－trnL序列与trnL－trnF序列拼接成trnT－trnF序列。2个单碱基A的插入／缺失将80条trnT－trnF序列分为3种单倍型，即H1～H3（表3）。在8个中国种群中各单倍型的分布情况不同（图1，表4），其中罗源 （LY）种群中单倍型种类最多，为3种，其次塘沽 （TG）、射阳 （SY）、大丰（DF）、崇明（CM）种群均为2种，宁波（NB）和乐清（LQ）种群最少，只有1种。可以发现，每一种单倍型均为多个种群所共有；其中H3型分布最为广泛，在各个种群中均有分布，其在总样本中发生的频率为77.6%（62条序列）；H1型分布于塘沽、射阳和罗源种群，H2型分布于朱旺、大丰、崇明和罗源种群，2种单倍型均占总样本的11.2%（图1）。

Blum等［20］根据互花米草cpDNAtrnT－trnF非编码区的序列差异将来自北美大西洋沿岸到墨西哥海湾及太平洋沿岸30个地区的598个样本分为42种单倍型（GenBank登录号：AY927278～AY927299、DQ486839～DQ486858），聚类为A、B、C和D四个大群，其中我国互花米草原产地北卡罗莱纳州、乔治亚和佛罗里达州的互花米草种群包含C、D两个大群的单倍体型，以C型互花米草为主。将所得的中国互花米草trnT－trnF序列同美国互花米草trnT－trnF单倍型序列进行序列比对，发现H1、H2、H3单倍型分别与美国互花米草单倍型C1、C2和C4序列一致，与Blum等［20］的研究相比较，未发现新的单倍型。

2.2 中国互花米草cpDNAtrnT－trnF序列的Indel多样性和单倍型多样性

8个种群总样本的单倍型多样性Hd值为0.379，除宁波和乐清种群外，各种群的Hd值介于0.282～0.639，其中罗源种群具有最高的单倍型多样性（0.639），塘沽和崇明种群次之（0.533）（表5）。宁波和乐清种群均只存在H3单倍型。

2.3 中国互花米草种群遗传多样性

互花米草种群内和种群间遗传差异分别为91%和9%（表6），说明互花米草的遗传多样性主要体现在种群内部，各种群之间虽然存在一定的差异，但种群间遗传分化较少，这与Fst值分析结果一致（表7）。根据cp－DNAtrnT－trnF非编码区序列变异估算出种群间基因分化系数Gst（0.103）、固定指数Fst（0.092），表明互花米草种群之间的分化程度较小。但是将种群两两比较，发现各种群间的Fst存在一定差异（0.017～0.333）。

各种群间的遗传距离（Nei distance，D）和遗传一致度（I）分析表明（表8），互花米草各种群的遗传距离平均为0.064，其中距离最大的为崇明与宁波、乐清种群之间（0.184），距离最小的为宁波与乐清种群之间（0.000）。同样的，互花米草各种群间的遗传一致度平均值为0.940，其中最高的为宁波与乐清种群之间（1.000），最低的为崇明与宁波、乐清种群之间（0.832）。朱旺种群与其他种群之间的遗传距离和遗传一致度与其他种群之间的差异较大。根据得到的遗传距离数据，使用非加权配对平均聚类法（UPGMA），对这8个种群进行聚类（图2），发现崇明种群与其他7个种群的遗传距离最大，宁波与乐清种群，朱旺与大丰种群，塘沽和罗源种群遗传距离较近。

图1 中国沿海8个互花米草种群cpDNAtrnT－trnF单倍型分布及频率Fig.1 The distribution and frequency of cpDNAtrnT－trnFhaplotypes among eight populations of S.alterniflorain China

表4 中国互花米草种群中cpDNAtrnT－trnF单倍型分布Table 4 The distribution of cpDNAtrnT－trnFhaplotypes among S.alterniflorain China

3 讨论

3.1 中国互花米草种群受遗传瓶颈效应影响

互花米草最早于1979年由南京大学从美国东南部的北卡罗莱纳州、乔治亚和佛罗里达州引种进入中国。在这3个州，Blum等［20］一共发现11种cpDNAtrnT－trnF单倍型，这3个州的互花米草种群均由多种单倍型组成，其中单倍型C2、C3、C4和C5是主要的类群。本研究结果表明，在8个中国互花米草种群中共发现3种cpDNAtrnT－trnF单倍型，分别对应于美国的C1，C2和C4三种单倍型。叶绿体trnT－trnF非编码区序列在种内具有一定的分辨能力，但叶绿体基因组属于单亲遗传，结构简单、稳定，极少或者不发生重组和种内变异。在中国互花米草种群中，未发现有别于美国原产地的新的cpDNAtrnT－trnF单倍型，这说明在短短30年内，中国互花米草叶绿体基因组可能并未发生太多改变。中国沿海互花米草种群多样性低于美国原产地种群，说明在cpDNAtrnT－trnF序列区域，中国沿海互花米草种群受到明显的瓶颈效应（genetic bottleneck）影响。这与沈栋伟［21］利用微卫星位点研究中国沿海互花米草种群遗传结构的结果一致。

互花米草在福建罗源的单倍型多样性高于浙江、上海、江苏、山东、天津种群，这在一定程度上揭示了中国沿海互花米草的传播路径。互花米草从美国引种进入我国后，首先于1980年10月在福建罗源进行了大规模的繁殖试种，从1982年开始，逐渐向江苏和其他地方引种［2］。由于遗传瓶颈效应，导致从罗源到中国其他地区的互花米草种群单倍型多样性减小，这与预期结果一致。

表5 中国互花米草种群cpDNAtrnT－trnF序列Indel多样性和单倍型多样性Table 5 The Indel diversity and Indel haplotype diversity of cpDNAtrnT－trnFsequence of S.alterniflora among 8populations in China

表6 互花米草种群基于cpDNAtrnT－trnF的分子变异方差分析Table 6 Analysis of molecular variance（AMOVA）for eight populations of S.alterniflorabased on cpDNAtrnT－trnFregion

表7 估计的互花米草种群间遗传分化（Fst）Table 7 Estimates of genetic differentiation（Fst）between eight populations of S.alterniflorain China

3.2 中国互花米草cpDNAtrnT－trnF单倍型的地理分布

本研究对中国沿海从福建罗源（北纬26°）到天津（北纬38°）8个种群的互花米草样本进行研究，发现H3单倍型（对应于Blum等［20］的C4单倍型）在所有种群中均有分布，且在各种群中分布频率占明显优势；H2单倍型（对应于Blum等［20］的C2单倍型）在福建、山东、江苏和上海均有分布（北纬26°～37°）。这与美国互花米草种群的情况一致，Blum等［20］观察到美国东海岸互花米草A、B单倍型分布于中北部；D单倍型分布于中南部；C类单倍型分布范围最广，其中C4单倍型分布最广，从南部的佛罗里达州（北纬24°～30°）到北部的缅因州（北纬43°～47°）均有分布，C2单倍型分布也较广，从南部的佛罗里达州 （北纬24°～30°）到北部的纽约州（北纬40°～45°）均有分布。而引种进入中国的恰好是分布范围最为广泛的C单倍型，这可能也是互花米草在中国沿海迅速扩张的原因之一。

H1单倍型（对应于Blum等［20］的C1单倍型）在福建、江苏和天津（北纬26°～38°）均有分布，80个样本中一共发现了9例C1单倍型。Blum等［20］一共分析了30个种群共598份样品，仅在南卡罗莱纳州发现1例C1单倍型，在中国互花米草的原产地北卡罗莱纳州、乔治亚和佛罗里达3个州未发现该单倍型。Blum等［20］在这3个州的6个种群中一共分析了70个样本，取样数的限制可能导致他们在这3个州未发现稀有的C1单倍型。这种在非本土种群中发现稀有等位基因或其频率上升的现象是有先例的。如在中华绒螯蟹 （Eriocheirsinensis）的研究中，研究人员发现引入欧洲的种群中最普遍的线粒体DNA单倍型，同时也是在美国加利福尼亚种群中发现的唯一单倍型，并没有在原产地种群中发现［22］；在美国的互花米草种群中也发现在引种地频率较低的单倍型在旧金山海湾内的频率明显升高［20］。这种单倍型频率发生显著改变的现象可能是由于引种时的遗传瓶颈以及小种群的遗传漂变引起的。

表8 Nei遗传一致度（对角线上）和遗传距离（对角线下）Table 8 Nei’s genetic identity（I，above diagonal）and genetic distance（D，below diagonal）between eight populations of S.alterniflorain China

图2 互花米草8个种群基于Nei’s遗传距离的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram for 8populations of S.alterniflorabased on Nei’s genetic distance

4 结论

通过分析我国互花米草种群cpDNAtrnT－trnF序列变异，可知中国互花米草种群受瓶颈效应影响明显，3种cpDNAtrnT－trnF单倍型在美国原产地均有发现，其cpDNAtrnT－trnF单倍型多样性远低于美国原产地；我国互花米草亦以在美国东海岸分布最为广泛的cpDNAtrnT－trnFC4单倍型为主（占77.5%）；互花米草种群间遗传变异较低，种群内多样性相对较高。由于叶绿体基因组属于单亲遗传，结构稳定，进化较慢，提供的信息有限，今后将选取进化速率更快的核基因组位点进一步分析种群的遗传结构和进化机制。

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