人免疫缺陷病毒-1p66蛋白在大肠埃希菌中低温长时间诱导表达和活性鉴定

张海锋,何红秋,刘 斌,杨 东,张小轶,谭建军,陈慰祖,王存新

(基础研究)

人免疫缺陷病毒-1p66蛋白在大肠埃希菌中低温长时间诱导表达和活性鉴定

张海锋,何红秋,刘 斌,杨 东,张小轶,谭建军,陈慰祖,王存新

目的人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H IV)-1逆转录酶是由 p66和 p51亚单位组成的异二聚体,抑制其活性可阻断 H IV-1的复制,是治疗获得性免疫缺陷综合征 (acquired immunodeficiency syndrome,A IDS)的重要靶点。获得大量纯化的 H IV-1 p66亚单位蛋白有助于研究其活性,为抗 H IV-1药物研究提供药物筛选平台。文中构建 H IV-1逆转录酶基因的原核表达系统,获取高纯度高活性的 H IV-1 p66亚单位重组蛋白。方法用 PCR从含 H IV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出编码 H IV逆转录酶 p66亚单位的基因,通过酶切、连接等方法构建重组质粒 pET-28a(+)-p66,并转化到宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后获得 H IV逆转录酶 p66亚单位蛋白。结果所构建了 pET-28a(+)-p66质粒酶切片段为 1680 bp,测序符合 H IV逆转录酶 p66亚单位编码基因序列。在 IPTG诱导下表达相对分子质量为 66 000的 H IV逆转录酶 p66亚单位蛋白。结论 成功构建了 pET-28a(+)-p66质粒,具有较高的 H IV逆转录酶 p66亚单位蛋白表达效率及活性。

人免疫缺陷病毒;逆转录酶;原核表达;纯化

0 引 言

H IV感染可导致 A IDS。H IV进入宿主细胞后在逆转录酶 (reverse transcriptase,RT)的作用下完成逆转录过程。H IV-1逆转录酶具有 3种活性:RNA依赖的DNA聚合酶活性、DNA依赖的DNA聚合酶活性和 RNase H活性[1-2],催化 H IV-1的单股正链RNA逆转录成为前病毒双链 DNA。阻断 H IV-1逆转录酶的活性可阻断 H IV-1的复制,因此 H IV-1逆转录酶是A IDS治疗的重要靶点。

H IV-1逆转录酶是pol基因编码产物的一部分,由 p66和 p51亚单位组成异二聚体。其中 p51亚单位是 p66亚单位 C末端 RNase H结构域在蛋白酶切割后形成的产物。p66亚单位含两个催化结构域:聚合酶结构域和 RNase H结构域。p51亚单位只含有聚合酶结构域,在 H IV-1逆转录酶异二聚体中仅起辅助作用[3]。H IV-1逆转录酶 p66蛋白在感染细胞中表达含量很低。为了进一步研究其生物学性质,为建立以逆转录酶为靶点的抗 H IV-1药物筛选平台,必须在体外获得大量纯化的 H IV-1 p66亚单位蛋白。文内采用大肠埃希菌 BL21(DE3)原核表达系统,通过低温长时增加蛋白的可溶性,用镍琼脂糖凝胶载体纯化,获得大量可溶性 H IV-1逆转录酶的重组蛋白。

1 材料与方法

1.1 工具酶和试剂 质粒 pET-28a(+)购自 Novagen公司,限制性内切酶和 T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司,TaqDNA聚合酶购自北京美莱博医学科技有限公司,PCR产物回收试剂盒购自Axygen公司,质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司,E.coliBL21(DE3)感受态细胞、DNA及蛋白质分子量标准购自天根生化科技有限公司,镍琼脂糖凝胶 FF购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司,InVisionTMHis-标记胶内染色试剂盒购自 Invitrogen公司。

根据目的蛋白序列特点,并参考 pET-28a(+)载体的多克隆酶切位点信息设计引物并引入N deI和BamH I双酶切位点。所用引物设计、合成及p66基因扩增产物序列测定均由上海生工生物工程技术服务公司完成。

1.2 H IV-1逆转录酶蛋白表达质粒的构建 根据H IV-1 HXB2p66基因读码框设计扩增引物,上游引物:5′-CTG CAT ATG(NdeI位点)CCCATT AGCCCT ATTG AGACTGTACC-3′,p66下游引物:5′-T ATGGATCC(BamHⅠ位点)TT A(终止密码子)TAGTACTTTCCTGATTC CAGC-3′。PCR产物为 1680 bp的全长p66基因,切胶回收后以NdeⅠ和BamHⅠ双酶切,产物与经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切的 pET-28a(+)载体连接。将所获 pET-28a(+)-p66质粒转化到E.coliBL21(DE3)中,用含 50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基筛选。挑取阳性克隆,用碱裂解法提取质粒DNA,进行NdeI/BamH I双酶切鉴定,对含有目的基因片段的克隆进行DNA序列测定,由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3 H IV-1逆转录酶蛋白的表达和检测 将测序正确的含有重组表达质粒的大肠埃希菌按 1%比例接种于含 50μg/ml卡那霉素的 SB培养基中,于37℃摇床 200 rpm培养至菌液 OD值达 0.6(600 nm),加入 IPTG至终浓度为 0.5mmol/L,于 25℃摇床 150 rpm诱导 24 h。收集菌体并用预冷的 PBS洗 1次,重悬于 pH 8.0含 0.3 g/L溶菌酶的平衡液 (20 mmol/L Tris,1 mol/L NaCl,10%甘油,2 mmol/Lβ-巯基乙醇,5 mmol/L咪唑,)中,反复冻融 3次并超声破碎细菌 (超声 8 s、间歇 8 s,50次,最大功率 400W),4℃离心半径 97mm,8000 r/mm离心 30 min,收集上清液。经过滤纸过滤后上样于镍琼脂糖凝胶柱,分别用含 30、60、100、200 mmol/L咪唑的A液进行梯度洗脱,收集洗脱液并进行 SDS-PAGE分析(12%分离胶),用 InVisionTMHis-标记胶内染色试剂盒染色。鉴定含目的蛋白的洗脱液,按 1∶500用 PBS透析后备用。取离心后的上清和沉淀进行 SDS-PAGE。

1.4 重组 H IV-1逆转录酶蛋白逆转录活性检测 用RT-PCR检测制备的 H IV-1 P66蛋白的酶活性。用Trizol法从新鲜猪肝组织提取总 RNA。以提取的猪肝细胞基因组RNA为模板,猪血清白蛋白(pig serum albumin,PSA)基因的扩增引物序列为:PSA-P1:5′-GCTCTAGATTCGAAACCATGAAGTGGG TG ACTTTTA-3′;PSA-P2:5′-CGGAATTCGGATCCACCACCACCGGCTAAGATC CCTCGAAT-3′。cDNA合成步骤如下[4-6]:将 2μl总RNA加入0.5ml ependoff管,再依次加入 4μl 25 mmol/L Mgcl2,0.8μl PS A-P2,2μl 10 mmol/L dNTP,2μl 10×AMV buffer,0.6μl AMV反转录酶或4μl重组H IV-1 P66蛋白,0.5μl重组Rasin核糖核酸酶抑制剂,最后加经焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)处理过的双蒸水至总体积为 20μl。逆转录反应条件:42℃60min,逆转录反应,95℃2min,逆转录酶的失活反应。PCR扩增反应体系总体积 100 μl,包括10μl cDNA溶液(逆转录合成的 cDNA稀释至100μl,取 10μl),特异性上下游引物各 0.5μl(100 μmol/L),1μlTaq Mix(2×),10μl 10×Taq Mixbuffer,加双蒸水至100μl。PCR反应条件:94℃预变性 5min, 94℃变性60 s,50℃退火50 s,72℃延伸120 s,循环扩增30次;最后72℃延伸5min。RT-PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结 果

2.1 H IV-1逆转录酶基因克隆和表达质粒的构建用上、下游引物进行 PCR扩增产物的电泳鉴定表明,扩增产物为 1680 bp的阳性条带,与已知 H IV-1逆转录酶p66基因长度一致,见图 1。将 PCR产物与 pET-28a(+)载体连接后,挑选出 1个克隆,用p66引物进行 PCR鉴定,PCR产物经测序鉴定,与已知H IV-1逆转录酶p66基因序列一致。

图 1 重组质粒 pET-28a(+)-p66NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定Figure 1 Restriction enzyme digestion analysis for pET-28a(+)-p66

2.2 重组 H IV-1逆转录酶 p66亚单位蛋白的 IPTG诱导表达条件和产物鉴定 在 IPTG终浓度为 0.5 mmol/L、温度 25℃、时间 24 h条件下,可溶性蛋白表达量最高,且在以后的纯化过程中可避免变性复性步骤,减少蛋白活性丢失。含 100mmol/L咪唑的洗脱液可洗出大量目的蛋白。含有目的蛋白的收集液用PBS以 1∶500(v/v)透析 24 h。透析后的蛋白分装保存于 -80℃。用 12%SDS-PAGE鉴定,经 InVisionTMHis-标记胶内染色试剂盒染色,在波长 302 nm处检测。表达蛋白的相对分子质量为66000,据此判断为目的蛋白,见图 2。

图 2 重组 HIV-1逆转录酶 p66亚单位蛋白的 SDS-PAGE结果Figure 2 12%SDS-PAGE analysis of the prote in expression and purification,the gel was sta ined by In-VisionTMHis-tag I n-gel Sta in

2.3 H IV-1逆转录酶蛋白逆转录活性的检测 用Trizol方法从新鲜猪肝组织中提取总 RNA。用所制备的重组 H IV-1逆转录酶 p66亚单位对猪肝细胞总RNA进行逆转录获得 cDNA,再用猪血清白蛋白基因的测序引物 PSA-P1和 PSA-P2进行 RT-PCR,得到 1821 bp的扩增片段。用 Promega公司提供的AMV逆转录酶对猪肝细胞总 RNA进行逆转录后获得同样大小的扩增片段,表明重组 H IV-1逆转录酶具有生物活性,见图 3。

图3 RT-PCR活性检测结果Figure 3 The activity result by RT-PCR

3 讨 论

H IV-1逆转录酶 p66蛋白在体内的表达量较低,因而研究较为困难,但该蛋白相对保守,现已在体外用原核或真核表达系统成功地表达了 H IV-1逆转录酶 p66蛋白[7],但制备重组蛋白的过程中还存在一些问题,如标签无法去除[8],纯化步骤复杂,真核系统表达的蛋白活性与原核系统相比较低。本研究采用了原核系统 pET-28a(+)表达载体,由于 pET-28a(+)载体表达的重组蛋白带有可与镍琼脂糖凝胶特异结合的 His标签,高浓度咪唑可将与镍琼脂糖凝胶柱结合的目的蛋白洗脱,从而简化了纯化步骤,一步性完成纯化过程。

柯越海等[9]以包涵体形式表达纯化的 p66蛋白,蛋白纯化过程中须对包涵体进行变性、复性,操作复杂且耗时费力。包涵体变性后蛋白质复性效率不高,会出现错误折叠或不折叠,影响纯化后 p66蛋白的功能活性。本研究采用低温过夜诱导 p66蛋白表达,从图 2可见。从破碎细胞上清液中纯化的p66蛋白含量高于从沉淀中纯化的蛋白量,表明低温长时间诱导可使 p66蛋白表达量明显提高。

1989年,齐多夫定 (zidovudine,AZT)获得美国FDA批准上市用于艾滋病的治疗,是第一个获得FDA批准使用的抗艾滋病药物。逆转录酶是抗 H IV药物的重要靶点,AZT就是以逆转录酶为靶点的 H IV抑制剂,是治疗艾滋病的主要药物。当前广泛使用的行之有效的高效抗逆转录病毒疗法 (highly active antiretroviral therapy,HAART,俗称鸡尾酒疗法)推荐使用至少1种逆转录酶抑制剂。随着抗病毒药物的广泛使用,耐药突变株的逐渐出现,亟待发现新药物来控制耐药性病毒株[10]。H IV-1在人体内的复制过程依赖逆转录酶和整合酶的相互作用[11],阻断逆转录酶与整合酶的相互作用可有效地阻断病毒在体内的复制,以逆转录酶和整合酶的相互作用为靶点进行药物筛选将成为今后的研究热点。本实验室已经建立了以 gp41蛋白和整合酶为靶点的药物筛选平台[12]。本研究获得了纯化的 p66蛋白,表达的 H IV-1 p66蛋白经鉴定具有体外逆转录酶活性,为研究整合酶与逆转录酶的相互作用并以这种相互作用为靶标进行研究提供了材料。本研究也有助于进一步研究逆转录酶与整合酶的相互作用。

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Purification of human immunodeficiency virus-1 p66 protein expressed at low temperature and long-t ime induction and the identification of its biological activity

ZHANG Hai-feng,HE Hong-qiu,L IU Bin,YANG Dong,ZHANG Xiao-yi,TAN Jian-jun,CHEN Wei-zu, WANG Cun-xin
(College of L ife Science and B ioengineering,Beijing University of Technology,Beijing100124,China)

ObjectiveReverse transcriptase,a heterodimer composed of subunits p66 and p51,is considered as an important target forA IDS therapy.H IV-1 replication can be blocked by inhibition of the reverse transcriptase activity.The obtainmentof purified H IV-1 p66 protein will help to study its activity and develop a screening assay for anti-H IV-1 drugs.In the present study,we constructed a p66 prokaryotic expression plas mid,and obtained highly pure and active H IV-1 p66 recombinant protein. Methods The sequence encoding H IV-1 p66 protein was amplified by PCR from the plasmid containing the H IV-1 HXB2 genome,and then cloned into the pET-28a(+)vector by restriction enzyme digestion and ligation to construct the prokaryotic expression plasmid pET-28a(+)-p66.Then itwas transfor med intoE.coliBL21(DE3)strain.IPTGwas used to induce the expression of p66.Finally,nickel affinity gelwas used to purify the p66 protein.ResultsA 1680 bp fragmentwas identified by restriction enzyme digestion.The sequencing result indicated that the H IV-1 p66 gene was cloned into pET-28a(+)correctly.ConclusionThe prokaryotic expression plas mid pET-28a(+)-p66 was constructed successfully.Highly expressed and active H IV-1 p66 recombinant protein was obtained.

Human immunodeficiency virus;Reverse transcriptase protein;Prokaryotic expression;Purification

R446.62

A

1008-8199(2011)02-0139-04

国际科技合作计划 (2010DFA31710);北京市自然科学基金(7082006)

100124北京,北京工业大学生命科学与生物工程学院[张海锋(理学硕士研究生)、何红秋、刘 斌、杨 东、张小轶、谭建军、陈慰祖、王存新]

王存新,E-mail:cxwang@bjut.edu.cn

2010-10-26;

2010-11-30)

(责任编辑:齐 名;英文编辑:郭联庆)