反相液相色谱法测定发酵虫草菌粉腺苷含量

张安宁，袁书林，，*，孙林超，张建华，郭小华

（1.江苏食品职业技术学院，江苏 淮安 223003；2.淮安淮大科技发展有限公司，江苏 淮安 223003）

反相液相色谱法测定发酵虫草菌粉腺苷含量

张安宁1，袁书林1，2，*，孙林超1，张建华1，郭小华2

（1.江苏食品职业技术学院，江苏 淮安 223003；2.淮安淮大科技发展有限公司，江苏 淮安 223003）

通过样品处理及检测条件的优化，建立发酵虫草菌粉腺苷含量的RP-HPLC检测方法。结果表明：Agilent-C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），乙腈+甲醇+水=5+5+90（体积比）作为流动相，检测波长260 nm，流速为1.2 mL/min，柱温35 ℃，进样量为20 μL，腺苷浓度在10μg/mL～50μg/mL时，浓度与峰面积呈线性关系，最低检出浓度为1.2μg/mL，定量限为4.0μg/mL，加标回收率为95.30%～105.20%，相对标准偏差为2.32%～5.70%。

虫草菌粉；腺苷；检测；RP-HPLC

冬虫夏草是我国特有珍稀名贵中药材，具有免疫调节、抗肿瘤、升白细胞、降血压、抗衰老、抗疲劳、调节内分泌、改善心肌缺血、抑菌、抗病毒、镇静、止血、抗惊厥、抗血小板凝结等多种作用[1-4]。由于天然冬虫夏草严格的寄生性与特殊的生态环境要求，产量十分有限，加上近年来盲目过度采挖，其野生资源逐年萎缩，开发野生冬虫夏草代用品势在必行，目前通常的做法是通过液体深层发酵培养虫草菌丝体以生产发酵虫草菌粉。发酵虫草菌粉在活性成分、药理作用等方面与天然冬虫夏草基本一致，可以做为冬虫夏草的替代品。目前被学术界和国家食品药品监管部门认可的发酵虫草菌粉生产菌种主要有蝙蝠蛾被毛孢（即中国被毛孢）以及蝙蝠蛾拟青霉、虫草被孢霉、蛹虫草等，虽然其功效成分和药理作用不尽相同，但腺苷是共同的主要有效成分之一，被用作发酵虫草菌粉的质量控制指标。

目前腺苷含量的检测方法主要有分光光度法、薄层色谱法（TLC），高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法（CE）等，其中以HPLC最适用[5-11]。本试验采用RPHPLC法对发酵虫草菌粉中的腺苷含量进行分析，优化了样品处理及检测条件，旨在建立发酵虫草菌粉腺苷含量的快速、准确检测方法，为发酵虫草菌粉类药品和生物制品的质量控制提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪、紫外检测器、化学工作站；Agilent－C18（4.6 mm×300 mm，5μm）；TU－1900双光束紫外可见分光光度计、GWA-UN2-F20超纯水器：北京普析通用仪器有限责任公司；BT25S（0.01 mg）电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SK-12E超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；0.45μm微孔滤膜。

甲醇（HPLC级）：江苏汉邦科技有限公司；乙腈（纯度99.9%）：天津市北辰方正试剂厂；腺苷标准品（纯度≥99%）：美国sigma公司；腺苷标准储备液（100μg/mL），腺苷标准使用液（10μg/mL）。

1.2 试验样品

发酵虫草菌粉：江苏食品职业技术学院江苏省食品微生物工程实验室保藏菌种，由淮安淮大科技科技发展有限公司采用液体深层发酵方法100 L罐中试生产。野生冬虫夏草：于2009年5月采集于青海玉树，自然风干。

1.3 试验条件

Agilent-C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），流动相：乙腈+甲醇+水=5+5+90（体积比），检测波长260 nm，流速为1.2 mL/min，柱温35 ℃，进样量为20 μL。

1.4 样品的制备

将样品于45℃烘干至恒重，根据样品中腺苷的含量称取适量置于100 mL碘量瓶中,加入20 mL 50%乙醇溶液,超声破碎30 min，转移到离心管中离心后取上清液移至旋转蒸发器中进行减压浓缩，再用流动相定容至25 mL，然后经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液供分析。同时制备1份空白溶液。

1.5 标准曲线的绘制

精密吸取腺苷标准使用液用流动相配制成浓度为0、10、20、30、40、50μg/mL的腺苷标准溶液。按1.3所述仪器条件进样20 μL，测峰面积A绘制标准曲线。在同样条件下，注入样品溶液20 μL，测峰面积，由标准曲线计算腺苷含量。

2 结果与讨论

2.1 腺苷光谱图和色谱图

腺苷紫外吸收光谱图、标准品色谱图、样品色谱图、样品加标提取色谱图如图1、图2、图3、图4所示。

2.2 检测波长的选择

通过扫描腺苷溶液的紫外吸收光谱可以看出，腺苷溶液在220 nm和260 nm处均有紫外吸收。在260 nm处紫外吸收达到最大，因此选择260 nm作为检测波长，具有较高灵敏度，腺苷与其它干扰峰能够完全分离，没有拖尾现象。

2.3 腺苷的标准曲线的确定

腺苷的标准曲线如图5所示，腺苷浓度在10×10-6g/mL～50×10-6g/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为 A=93.659C+30.829，R=0.9994。

2.4 提取剂、提取剂浓度及用量的选择

样品中的腺苷可用不同溶剂来提取，本试验采用不同浓度的甲醇或乙醇进行提取。试验表明乙醇有溶剂干扰，故选用甲醇作为提取剂。

经用25%、50%、75%、100%甲醇浓度进行试验，结果见图6。

由图6可知：50%甲醇提取率最大。分别用10、20、30、40、50 mL提取剂进行试验，结果见图7。

由图7可知：20 mL提取剂时腺苷的提取量达到最大，故提取剂的用量选定为20 mL。

2.5 超声波提取时间的选择

称取样品适量，置于具塞三角瓶中，加入20mL50%的乙醇溶液，再分别选择 0、10、20、30、40、50 min等不同的超声波处理时间提取，而后转移到离心管中，5000 r/min离心10 min，取上清液进行浓缩、定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，待HPLC检测并对比腺苷溶出量，见图8。

由图8可以看出，不经过超声波处理的几乎测不出腺苷，随着处理时间的增加，腺苷溶出量明显增加，超声波处理30 min腺苷的溶出量达到最大，溶出量达到5.39 mg/g。

2.6 流动相及配比的选择

在其它色谱条件不变情况下，分别用乙腈＋水、甲醇＋水、甲醇＋0.01 mol/L磷酸二氢钾、甲醇＋0.06 mol/L磷酸二氢钾＋四氢呋喃、乙腈＋甲醇＋水作为流动相进行试验，试验表明，乙腈+甲醇+水作为流动相，分离效果最好。通过对流动相乙腈＋甲醇＋水进行配比试验，试验表明乙腈＋甲醇＋水＝5+5+90，峰形良好，保留时间适中，与其它干扰峰能够完全分离，没有拖尾现象。

2.7 方法考察

精密称取高、中、低3种腺苷含量的样品进行处理得到待测溶液，各重复测定6次，结果见表1。

表 1 精密度试验结果Table 1 Results of precision test

由表1可以看出，方法有良好的重现性，重复6次测定的相对标准偏差RSD分别为2.32%、3.54%、5.70%。

在待测样品中加入一定量的腺苷标准品，按照样品处理方法，制得加标待测样品溶液，各重复测定6次，结果见表2。

表 2 回收率试验结果Table 2 Results of recovery test

由表2可见回收率在95.3%～105.2%之间。

按选定的条件对空白溶液进行12次测定，根据公式LOD=3Sb/S、LOQ=10Sb/S（Sb为空白溶液的峰面积标准偏差，S为回归直线的斜率）求得方法的检出限为1.2μg/mL；定量限为4μg/mL，说明本分析方法可满足发酵虫草菌粉中腺苷含量检测要求。

2.8 不同发酵虫草菌粉按本方法测得的腺苷含量

采用本试验建立的方法，检测了不同发酵虫草菌粉的腺苷含量，结果如表3所示。

表 3 样品中腺苷的含量Table 3 Results of the adenosine concentrations in samples

从表3可以看出，不同发酵虫草菌粉的腺苷含量不同，其中以中国被毛孢菌粉含量最高，而蛹虫草菌粉最低，但都要高于野生冬虫夏草。

3 结论

本试验通过样品的超声波前处理、提取溶剂浓度、检测波长、流动相及配比、精密度、回收率等进行优化、讨论，建立了发酵虫草菌粉腺苷含量的RP-HPLC检测方法。结果表明：Agilent－C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），乙腈+甲醇+水=5+5+90（体积比）作为流动相，检测波长260 nm，流速为1.2 mL/min，柱温35℃，进样量为20 μL，腺苷浓度在10μg/mL～50μg/mL时，浓度与峰面积呈线性关系，最低检出浓度为1.2μg/mL，定量限为4.0μg/mL，加标回收率为95.30%～105.20%，相对标准偏差为2.32%～5.70%，测定组分峰形良好，与其它峰能够完全分离，没有拖尾现象，稳定性好、回收率高、简便快速、结果准确。

本方法在样品前处理、腺苷的提取、流动相的优化、有害试剂的使用量、环境的污染、操作过程中腺苷的损失、方法的精密度、准确度等方面均优于参考文献，经大量样品分析表明，此方法所受干扰较少，具有快速、简便、经济的特点。

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Determination of Adenosine in the Mycelia of Cordyceps Epiphytes by RP-HPLC Method

ZHANG An－ning1，YUAN Shu－lin1，2，*，SUN Lin－chao1，ZHANG Jian－hua1，GUO Xiao－hua2
（1.Jiangsu Food Science College，Huaian 223003，Jiangsu，China；2.Huaian HITEK Science and Technology Development Co.，Ltd.，Huaian 223003，Jiangsu，China）

The methold for the determination of adenosine concentrations in the mycelia of cordyceps epiphytes by RP－HPLC was established through the optimization of sample process and detection conditions.The results showed that the chromatographic conditions included Agilent－C18column（4.6 mm × 300 mm，5μm）and the mobile phase consisting of acetonitrile，methanol and water by 5∶5∶90（volume ratio）.The detection wavelength was at 260 nm.The flow rate was 1.2 mL/min.The column temperature was at 35 ℃.The sample dose was 20 μL.When the concentration of adenosine was at 10μg/mL to 50μg/mL，the perfect linearity between concentration and peak area ratio was obtained.The detection limit was 1.2μg/mL and the quantificational limit was 4.0μg/mL.The recovery rate was 95.30%to 105.20%.The relative standard deviation（RSD）was 2.32%to 5.70%.

Mycelia of cordyceps epiphytes；adenosine；determination；RP－HPLC

淮安市科技支撑计划（工业）项目（HAG08061）；淮安市科技型中小企业技术创新引导资金项目（HAC201003）

张安宁（1956—），男（汉），教授，高级工程师，学士,研究方向：食品生物技术开发与应用。

*通信作者：袁书林（1977—），男（汉），副教授，博士，研究方向：营养保健与功能性食品。

2011-03-24