GDF5基因启动子表达载体的构建

旭，孙立胜，史冬泉，

(南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 210008)

生长分化因子5(GDF5)，又称软骨来源形成蛋白1，属骨形态发生蛋白(BMP)家族，也是转化生长因子 β(TGF-β)超家族成员之一［1］，是骨骼系统的主要调节因子，在骨骼发育过程中对软骨内成骨，骨与关节的形成起着重要作用［2］。2010年1～12月，我们采用PCR技术成功构建含GDF5基因表达载体pGL3-GDF5。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 载体pGL3-Basic，大肠杆菌DH10b感受态细胞(南京大学模式动物研究所高翔实验室馈赠)，高保真酶Primer Star，dNTP，T4连接酶，限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ(大连宝生物工程有限公司)，基因组DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(Promega公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GDF5的GenBank中NM000557检索序列，设计一对特异性引物(上海英骏生物技术有限公司合成)，5'端分别加入BglⅡ、HindⅢ酶切位点。上游引物序列:5'-GAAGATCTCT GGAAAGGATTCAAAACTAGGG-3'，下游引物序列:5'-CCCAAGCTTGGGGACAGATCCTGCTTT-3'。

1.2.2 基因组DNA提取 用基因组DNA抽提试剂盒提取健康人外周血基因组DNA，作为PCR扩增模板。

1.2.3 PCR 扩增 PCR 反应体系50 μl，反应参数:94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，于72℃延伸5 min。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，按DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化回收。

1.2.4 重组质粒pGL3-GDF5的构建 分别用限制性内切酶 BglⅡ和 HindⅢ对回收的 PCR产物和pGL3-Basic载体质粒进行双酶切，按照DNA凝胶回收试剂盒说明，切胶纯化酶切后的pGL3-Basic载体质粒大片段和GDF5基因启动子片段，在T4连接酶的作用下，将两者16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH10b感受态细胞，菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37℃培养箱中培养12 h，随机挑取2个阳性克隆，置于LB/Amp液态培养基中震荡培养12 h，根据质粒提取试剂盒说明书，提取质粒DNA(pGL3-GDF5)，BglⅡ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

2 结果

2.1 GDF5基因扩增结果 通过上、下游引物进行PCR扩增后，得到1条长度为854 bp的PCR产物，见图1。

图1 GDF5基因PCR产物电泳结果

2.2 重组质粒pGL3-GDF5连接后鉴定结果 挑选阳性克隆菌落，PCR鉴定结果所产生的结果见图2。pGL3-Basic质粒大片段为4 801 bp，如插入854 bp外源基因GDF5启动子，其扩增长度应为两者之和(约5 655 bp)，证明两者连接成功。

图2 质粒连接后鉴定结果

2.3 重组质粒双酶切及测序鉴定 重组质粒载体pGL3-GDF5经BglⅡ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，显示出4 801 bp的大片段和854 bp的小片段，与理论结果相符，证明质粒构建成功，见图3。双向测序结果与GenBank中GDF5序列完全匹配。

3 讨论

图3 重组质粒双酶切电泳结果

GDF5是一种分泌性多功能蛋白［3］。研究发现GDF5是一种在胚胎肢体发育尤其是软骨与关节形成中扮演关键角色的调节因子，在机体软骨形成及发育中的作用受到人们的关注。首先GDF5能够促进间充质细胞在关节将要形成的部位聚集，这是软骨形成的最初步骤;后期主要是促进间充质细胞向成软骨细胞分化，刺激软骨细胞增生、肥大［4～7］。

关节软骨损伤的修复是临床治疗中的难点［8］。由于关节软骨的不可再生性，一旦发生损伤，严重影响肢体关节功能。目前，GDF5在一些试验中对于关节软骨损伤的修复作用已经得到了证实［9，10］。体外试验也表明GDF5能够增强软骨细胞聚集、诱导软骨分化并促进其成熟［11］。可见探讨软骨损伤、修复过程的分子机制将对临床骨性关节炎的治疗有极大影响。

pGL3-Basic载体不含启动子及增强子，通过将启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游，即可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。与其他检测系统相比，荧光素酶检测系统具有非放射性、半衰期较短、操作简单、结果直观、灵敏度高等优点。因而适合对基因瞬时表达的研究，是研究转录调控基因的一种理想的报告基因载体。研究表明质粒pGL3-Basic的多克隆位点中含的BglⅡ和HindⅢ内切酶位点，在设计扩增目的片段的上下游引物中加上同样的双酶切位点，这样在构建重组表达质粒的连接中就可以使目的片段按正确的方向插入载体中，即定向克隆。

本实验采用RT-PCR方法合成GDF-5启动子基因，并插入到质粒pGL3-Basic上，经过酶切鉴定和测序证实表达载体pGL3-GDF5构建成功，为进一步研究GDF5在软骨发育及分化中的作用机制提供直接的实验依据，为体外诱导软骨形成提供实验基础，为将来用于临床治疗骨关节软骨损伤开拓了思路。

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