多粮小曲清香型白酒发酵过程中微生物动态变化研究

王万能，王 鹏，王 东，娄国平，龚晓林，范新发，赵远雕，邱重晏

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054;2.重庆市江津酒厂(集团)有限公司，重庆 402284)

中国传统白酒由于其独特的发酵工艺和产品风格，在世界六大蒸馏酒中占有重要的地位。小曲清香白酒在我国历史悠久，是具有传统特色的一个主要酒种。重庆小曲清香白酒主要以高梁等粮谷为原料，根霉小曲为糖化发酵剂，采用整粒原料经蒸煮、做箱培菌糖化、续糟固态发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成。它以其醇香清雅、糟香突出、回甜、余味净爽等独特风格而深受饮者喜爱［2］。

20世纪80年代至今，白酒微生物的研究进入了高潮，各酒厂、科研机构和学校纷纷对白酒微生物进行研究。窖池中的生态因素与窖池中的微生物相互联系、相互作用、相互制约协调共同构建成了窖池特定微生物生态系统［3］。同时，由于曲药以及现场生产环境的微生物因素，在连续投料生产每一批次的窖池酒醅中，周而复始地重复进行着微生物的消长和变化过程，因此在同一个生产地点和成熟的生产计数条件下，微生物的构成基本趋于稳定，在正常的发酵发酵状态下微生物的动态变化是趋于一致的［4］。

本研究对江津小曲清香型白酒生产过程中的微生物进行分离、纯化、计数和鉴定，一方面了解江津酒酿造的主要菌种及主要特性和作用，另一方面可以了解有害微生物的种类、性能和作用。通过了解控制发酵工艺来促进有益菌的作用、抑制有害菌的活动，提高和稳定酒的产量和质量，为发现白酒发酵过程微生物的动态变化规律和窖池发酵机理奠定一定的基础［5］。

1 材料与方法

1.1 试验窖池

重庆市江津酒厂生产窖池。

1.2 样品采集

从制箱开始取样，取制箱一天样品。发酵中分别按入窖1、2、3、4、5 d跟踪取样。取样深度在50 cm处，两边与中间三点混合均匀。

1.3 微生物的分离计数

1.3.1 根霉、芽孢杆菌及其他细菌的分离计数

配制LB、PDA培养基，无菌操作取样2 g于灭菌的小烧杯中，加入灭菌水50 mL，稀释倍数为10－3、10－4、10－5。可用灭菌的1.5 mL 离心管充分搅拌混匀。取0.2 mL的不同稀释梯度浓度的菌液，涂布于LB、PDA固体培养基上，每个浓度重复2次，培养1 d，观察不同的菌落，分类计数。计算得:纯菌落数(个/g)=菌落数×稀释倍数×125。通过《伯杰氏细菌鉴定手册》配合细菌生理生化实验鉴定芽孢杆菌及其他细菌。通过《真菌鉴定手册》鉴定出根霉菌［6］。

1.3.2 酵母菌的分离计数

将2 g样品置50 mL无菌水，充分搅拌混匀，稀释10－3～10－5个浓度梯度。用枪头吸取0.2 mL的3个梯度稀释好的悬液分别涂布于YEPD培养基平板，倒置于28℃恒温培养箱中培养。待培养基表面长出均匀菌落后计数。置于28℃恒温培养箱中培养2～3 d后观察，照相记录菌落颜色和形态。然后依据《常见与常用真菌》进行观察与检索［7－8］。

1.3.3 乳酸菌的分离计数

MRS培养基冷却至46℃左右，加入质量分数为10%的碳酸钙粉末，备用。样品稀释:无菌操作取样2 g于灭菌的小烧杯中，加入灭菌水50 mL，稀释倍数为 10－3、10－4、10－5。分别吸取不同稀释度的稀释液2 mL置于制作好的MRS培养基内，铺匀。用溶化冷却至46℃左右的MRS培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成夹层平板［9］。培养和计数:将平皿倒置于37℃恒温箱内培养24～48 h，观察长出的细小菌落，取有溶钙圈的菌落计数［10］。涂片，革兰氏染色，镜检，对革兰氏染色呈阳性的杆状细菌进行纯化培养。

2 结果与分析

2.1 各类菌种群在发酵过程的变化

在菌落生长到适宜对菌落进行计数时，对培养皿中的菌落计数，并记录计数结果。本研究只对发酵过程中的主要菌落进行了分离鉴定计数，主要是根霉、酵母、芽孢、乳酸菌及其他细菌［11］。各类菌在发酵过程的变化如表1所示。

表1 各类菌在发酵过程的变化104个/g(酒醅)

2.2 发酵过程中微生物变化的动态曲线分析

白酒发酵过程中的主要优势菌群主要有酵母菌、乳酸菌、根霉、芽孢杆菌等以及其他细菌。这些微生物相互作用、相互协调在发酵过程中发挥主要作用。微生物菌群数量的多少、种类对酒质的好坏有着很大的影响，所以可以调节其中微生物的动态变化使有害菌群与有益菌群达到平衡的状态，使酒质大大提升，同时提高粮食利用率［12］。多粮小曲清香白酒发酵过程中微生物变化趋势如图1所示。

通过对本实验的微生物进行分类鉴定、计数、绘制动态分析曲线，可更清晰地观察和分析。根霉作为优势菌，在入窖发酵1 d后，菌落数量达到400×104个/g，然后随着环境的变化，其数量越来越少，到出窖时则减少到最少，只有2个/g。

图1 多粮小曲清香白酒发酵过程中微生物变化趋势

酵母菌属酵母，作为主要优势菌，一直增加到发酵2 d，随后虽有减少，但是一直到发酵后期都能被检测到，酵母在酒精生产起最主要作用，其菌落数量高达740×104个/g。

乳酸菌属细菌在入池前没有检测到，而在发酵后期逐渐增多，发酵第4 d菌落数达到12.8×104个/g，发酵5 d则又降低。

芽孢在入池时最多，可能是空气等环境中的芽孢的进入。有关文献报道芽孢可能是产淀粉酶有关。随后则逐渐减少，发酵后期依然可检测到，菌落数量也高达5 000个/g。

其他细菌在发酵第2 d数量最多，随后由于氧气的减少、pH值以及酒精的出现等环境的变化，细菌锐减，但是发酵末期依然有细菌存在。

3 分析与讨论

根霉细胞中含有一定的酒化酶系，能边糖化边发酵，可使小曲酒整个发酵过程中自始至终边糖化边发酵，所以发酵作用较彻底，淀粉出酒率进一步得到提高，这一特性是其他霉菌所没有的。发酵1 d后就达到了最高值，随后有所减少，但一直伴随在发酵过程中［13－14］。

酿酒酵母主要生长在含糖量较高的偏酸性环境中，是兼性厌氧微生物，在繁殖时需要供给大量空气，具好气性;在进行酒精发酵时，它就不需要空气，具厌气性［15－17］。在开始时数量不多，随着发酵时间增加发酵环境更适宜酵母菌的生长，到第二天达到了最高值，随后减少，但在发酵过程中在大部分时间里是最优势菌。

从数据上来看乳酸菌数量明显低于其他菌种数量。

酒中的众多的香味成分来源于细菌的代谢，细菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌等，乳酸菌能使发酵糖类产生乳酸，乳酸通过酯化产生乳酸乙酯，乳酸乙酯使白酒有独特的香味，因此白酒生产需要适量的乳酸菌。但是乳酸菌过量使用会使酒醅酸度过大，影响出酒率和酒质。酒中含乳酸乙酯过多，会使酒气带闷香［18］。芽孢杆菌在初期数量最大，与车间生产环境有很大关系，随后逐渐减少，芽孢杆菌与产淀粉酶有很大关系［19］。其他细菌没有依依分类鉴定，它们可能也与酒的香气产生有很大关系，有待于确定，希望今后在这方面进一步开展一些研究工作。

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