枯草芽孢杆菌3－2产细菌素发酵条件的优化

杨宇清，郑一敏，胡 杨，乐 亮，江 娟，王 宁，林海珠

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

随着社会的进步，人们越来越追求方便、快捷、安全、健康的食品，但是食品在加工、储藏过程中很容易受到细菌、霉菌、酵母的污染，导致腐败变质，因此，研发安全、有效的食品防腐剂，是食品工业发展的关键问题之一［1］。枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在，对人畜无害，且不污染环境，具有极好的抗菌活性和极强的抗逆能力［2－3］，其代谢产物具有极高利用价值和开发前景［4］。本文以一株本实验室分离得到的具有很强拮抗作用的枯草芽孢杆菌为研究对象，对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化，为该菌种规模化发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

1.1.1 菌种

供试菌株:枯草芽孢杆菌3－2(重庆理工大学药学与生物工程学院天然药物实验室保藏);指示菌株:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(重庆理工大学药学与生物工程学院天然药物实验室保藏)。

1.1.2 培养基

种子液体培养基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值为7.0 ～7.2;种子固体培养基:在液体培养基的基础上添加1.5%琼脂粉;指示菌培养基:同种子培养基。

1.2 发酵液的制备

保存菌种经活化后从斜面上挑取一环接种于装有30 mL种子培养基的100 mL的三角瓶中，37℃ 下180 r/min摇床培养12 h，制得种子液。以5%接种量将种子液接种到装有200 mL发酵培养基的500 mL的三角瓶中，37℃下180 r/min摇床培养24 h制得发酵液。

1.3 指示菌悬液的制备［5］

保存菌种经活化后从斜面上挑取一环接种于装有30 mL种子培养基的100 mL的三角瓶中，37℃ 下180 r/min摇床培养24 h，制得菌悬液.用10倍稀释法将菌液稀释、计数，求得菌悬液浓度，稀释成106～107mL－1保存备用。

1.4 活性评价方法－琼脂扩散法［6］

发酵液经10 000 r/min离心10 min收集上清液，再经0.22 μm过滤膜过滤除菌，即制得抗菌粗提液。取上述指示菌菌悬液200 μL与15 mL固体培养基混匀倒平板，待培养基凝固后，用无菌镊子放入吸有抗菌初提液500 μL的自制海绵圈，37℃培养24 h后测定抑菌圈直径，重复3次。

1.5 试验设计

1.5.1 发酵培养基的筛选

选取下述5种常用的细菌培养基作为供试菌的发酵培养基，筛选最适发酵培养基，每组试验重复3次。培养基如下:

1)LB 培养基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值为7.0 ～7.2。

2)NB 培养基:牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值为7.0。

3)BPY 培养基:葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，牛肉膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值为7.0。

4)Landy培养基:葡萄糖 20.0 g，L－谷氨酸5.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，FeSO4·6H2O 0.15 mg，MnS04·H2O 5.0 mg，CuSO4·5H2O 0.1 6mg，蒸馏水1 000 mL，pH 值为7.0。

5)NYD 培养基:牛肉膏 8.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 1.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值为7.0。

1.5.2 培养时间对产细菌素的影响

采用最适发酵培养基，按本文1.2节方法制备发酵液，每隔4 h取样，按本文1.4节方法测定发酵液的抑菌活性，考察培养时间对产细菌素的影响，重复3次。

1.5.3 培养温度对产细菌素的影响

分别在28、30、32、35、37、40 ℃条件下培养。培养条件按本文1.5.2节优化后条件，并按本文1.4节方法测定各发酵液抑菌活性，考察温度对产细菌素的影响，重复3次。

1.5.4 初始pH对产细菌素的影响

以最适发酵培养基为基础，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH 分别调节 pH 值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，培养条件按本文 1.5.3 节优化后条件，并照本文1.4节方法测定各发酵液抑菌活性，考察培养基初始pH值对产细菌素的影响，重复3次。

1.5.5 装液量对产细菌素的影响

在500 mL三角瓶中分别装入体积为50、100、150、200、250的最适发酵培养基。培养条件为本文1.5.4节优化后条件，并按本文1.4节方法测定各发酵液抑菌活性，考察装液量对产细菌素的影响，重复3次。

1.5.6 接种量对产细菌素的影响

按本文1.2方法制备种子液，分别以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0% 和8.0%(v/v)的接种量接种，培养条件按本文1.5.5节，并按本文1.4节方法测定各发酵液抑菌活性，考察接种量对产细菌素的影响，重复3次。

1.5.7 接种龄对产细菌素的影响

按本文1.2节方法制备种子液，分别取培养12、18、24、30和36 h的种子液接种于最适发酵培养基中，培养条件按本文1.5.6节优化后条件，并按本文1.4方法测定各发酵液抑菌活性，考察接种龄对产细菌素的影响，重复3次。

2 结果

2.1 发酵培养基筛选结果

5种发酵培养基发酵液抑菌活性的结果如表1所示。培养基的组分及含量对发酵液抑菌活性的影响很大，BPY培养基的发酵液抑菌活性最高，而其他4种培养基的发酵液抑菌活性都较低，因此，选择BPY培养基作为供试菌种的最适发酵培养基。

表1 不同培养基发酵液抑菌活性测定结果

2.2 培养时间对产细菌素的影响

培养时间对菌株3－2产细菌素的影响的试验结果如图1所示，发酵4～8 h已经有细菌素产生。24 h后，发酵液的活性已达到最高。延长发酵时间活性无明显变化，且发酵液对两种指示菌的抑菌效果的趋势相相似，所以选择24 h作为发酵终点。

图1 培养时间对产细菌素的影响

2.3 培养温度对产细菌素的影响

对3－2菌株产细菌素的影响的试验结果如表2所示。随着温度的升高，发酵液的抑菌活性逐渐增强，35℃时活性最强。温度继续升高，活性开始下降。当温度升至40℃，发酵液活性已经很弱，所以选用35℃作为最适发酵温度。

2.4 初始pH值对产细菌素的影响

初始pH对菌株3－2产细菌素的影响的试验结果如表3所示。pH值在5.5～8.0内菌株均能产细菌素，以pH值为7.0时活性最强，pH 值为5.0和8.5时无抑菌活性(细菌可以在这2个pH值条件下生长，数据本文没列出)，所以确定最适初始pH 值为7.0。

表2 发酵温度对产细菌素的影响

表3 初始pH对产细菌素的影响

2.5 装液量对产细菌素的影响

装液量对菌株3－2产细菌素的影响的试验结果如表4所示。当装样量达到100 mL后随着装液量的增大，抑菌活性呈下降趋势，所以确定最适装样量为100 mL/500 mL。

表4 装液量对产细菌素的影响

2.6 接种量对产细菌素的影响

接种量对3－2菌株产细菌素的影响的试验结果如表5所示，当接种量为3%后，发酵液的抑菌活性最强，继续增大接种量，发酵液活性无显著变化，考虑实验的经济性，选用3%作为最佳接种量。

表5 接种量对产细菌素的影响

2.7 接种龄对产细菌素的影响

接种龄对3－2菌株产细菌素的影响的试验结果如表6所示。菌株产细菌素水平随着接种龄的变化而变化，接种龄在12 h的发酵液抑菌活性最强，种龄超过12 h后，发酵液抑菌活性开始下降，所以选用12 h作为种子的发酵时间。

表6 接种龄对产细菌素的影响

3 讨论

不同微生物生长情况不同或合成的发酵产物不同，所需的培养基也就有所不同，但是对于所有发酵生产用的培养基的设计也是存在某些共同点可供遵循的，即所有的发酵培养基都必须要有可以提供微生物生长繁殖和产物合成所需要的碳、氮源、无机源、生长因子和水等。对于大规模的发酵生产，除了考虑以上的微生物需要外，还必须考虑培养基原料的价格以及来源。对于3－2菌株发酵培养基的筛选，本试验通过摇瓶实验在5种基础培养基的基础上筛选最适的培养基，然后再在此最适的培养基的基础上对其发酵条件进行优化，结果证明不同的培养基组分及配比对枯草芽孢杆菌3－2产细菌素有不同的影响，BPY为最适的培养基。随着发酵时间的延长细菌素产量也相应的增加，24 h时产量达到最大，继续发酵产量没有明显增加，推测随着发酵时间的延长培养基内营养物质也相应的降低，阻碍了细菌素的进一步产生。温度对3－2产细菌素有明显的影响，温度过高或过低都不利于其产生细菌素。在中性环境中最易产生细菌素，通气量对3－2产细菌素也有明显的影响，通气量过大或过低都不利于产生细菌素。接种量、种龄对其细菌素的产生有一定的影响。

枯草芽孢杆菌3－2生长快，易产生细菌素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有很好的抑菌作用，是一株很有潜力开发用于天然防腐剂的菌株。本试验最终确定了3－2产细菌素的最佳培养基和培养条件，为下一步的研究和开发应用奠定了基础。

［1］秦艳，李卫芬，黄琴.枯草芽孢杆菌发酵条件的优化［J］.饲料研究，2007(12):70 －74.

［2］裘娟萍，黄海婵.枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展［J］.浙江农业科学，2005(3):213－217.

［3］王星云，宋卡魏，张容意.枯草芽孢杆菌菌剂的开发应用［J］.广西热带农业，2007(2):32－35.

［4］赵瑞，江木兰，胡小加，等.培养条件对枯草芽孢杆菌TU100生长和产生抗菌物质的影响［J］.中国油料作物学报，2007，29(1):69 －73.

［5］方传记，陆兆新，孙力军，等.淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化［J］.中国农业科学，2008，41(2):533 －539.

［6］陈雪，侯红漫，陈莉，等.产细菌素芽孢杆菌的筛选及发酵条件的研究［J］.中国酿造，2008(9):26－30.

［7］惠明，窦丽娜，田青，等.枯草芽孢杆菌的应用研究进展［J］.安徽农业科学，2008，36(27):11623 －11624，11627.