四黄软膏质量标准研究*

黄毅，彭东洲，郑维思，孙立敏，云玉琼，谭红，朱昊宇

(广东省珠海市慢性病防治站，519000)

四黄软膏是我站研制的外用软膏，由黄芩、黄柏、大黄、硫磺等药材组成，具有清热燥湿、泻火解毒、除湿止痒等作用，临床上用于治疗阴囊湿疹、慢性皮炎、毛囊炎等症。为更好地控制该制剂质量，确保临床使用安全有效，笔者对方中黄柏和大黄进行了薄层色谱(thin layer chromatography，TLC)鉴别，并采用高效液相色谱法测定了制剂中黄芩苷的含量。

1 仪器与试药

岛津LC-20A型高效液相色谱仪，岛津SPD-20A紫外检测器，Sartorius BS分析天平(d=0.1 mg)，C5860A型超声波清洗器(超声频率:40 kHz，超声功率:180 W)，ZF-20型紫外线分析仪，层析用硅胶(青岛海洋化工厂)。黄柏对照药材(批号:121510-200703)、大黄对照药材(批号:120984-200602)、黄芩苷对照品(批号:110715-200815)均购于中国药品生物制品检定所，四黄软膏(本站提供，批号:20091208，20090914，20090728)，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄柏的TLC鉴别 取本品0.5 g，加无水乙醇3 mL，超声处理10 min，上清液作为供试品溶液;取黄柏对照药材0.06 g，加无水乙醇3 mL，超声处理10 min，上清液作为对照药材溶液;取阴性样品(处方各味药材，去黄柏，按四黄软膏制备工艺制成)，同法制成阴性对照溶液;照TLC法(《中华人民共和国药典》2010年版附录Ⅵ B)实验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂，展开12 cm(展开温度20℃，相对湿度65%)，取出，晾干，置紫外光灯(波长365 nm)下检视(图1)。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上显相同颜色的荧光主斑点(Rf分别为0.41和0.48)，而阴性对照色谱在相应的位置上无干扰。

2.2 大黄的TLC鉴别 取本品6 g，加水2 mL搅拌使分散均匀，加入甲醇30 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，加水20 mL、盐酸2 mL溶解，水浴回流30 min，冷却，用乙醚分2次振摇提取，每次15 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液;取阴性样品(处方各味药材，去大黄，按四黄软膏制备工艺制成)，同法制成阴性对照溶液;取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。照TLC法(《中华人民共和国药典》2010年版附录ⅥB)实验，吸取上述3种溶液各20 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)为展开剂，展开12 cm(展开温度20℃，相对湿度65%)，取出，晾干。置于365 nm波长紫外灯下检视，结果见图2。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上显相同颜色的荧光主斑点(Rf分别为0.40和0.57)，置氨气中熏蒸后，颜色变深，而阴性对照品色谱在相应的位置上无干扰。

图1 4种溶液的TLC图谱1.黄柏对照药材;2.阴性对照;3，4.样品(批号:20091208)

图2 6种溶液的TLC图谱1，2.样品;3，4.大黄对照药材;5，6.阴性对照

2.3 黄芩苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇∶1%冰醋酸(60∶40);流速:1 mL·min-1;检测波长:276 nm;柱温:40℃;进样量:10 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每毫升约含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品(批号:20091208)0.5 g，精密称定，置于10 mL烧杯中，加入水2.5 mL，50～60℃水浴中温热使其分散，放冷，转移至25 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀，高速离心，取上清液，即得。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 取处方量的除黄芩以外的各组分，按四黄软膏制备工艺制成阴性样品，再按“2.3.3”项方法制成阴性对照溶液。

2.3.5 系统适用性实验 取上述对照品、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，照“2.3.1”项色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，理论塔板数按黄芩苷峰计算为2 533;待测峰与其他组分峰分离度良好，拖尾因子及分离度分别为1.03和2.69，均符合《中华人民共和国药典》2010年版要求，阴性无干扰，见图3。

2.3.6 线性范围考察 取黄芩苷对照品约10.0 mg，精密称定，置于100 mL量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀;精密量取该溶液6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀;分别进样 1，5，10，15，20 μL，记录色谱图，以对照品的量(X，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:Y=4E+06X-72 754，r=0.999 8，结果黄芩苷在0.06～1.20 μg范围内呈良好的线性关系。

2.3.7 加样回收率实验 取软膏(批号:20091208，黄芩苷含量2.55 mg·g-1)0.25 g，共9份，置于10 mL烧杯，精密称定，加水2.5 mL，在50～60℃加热轻摇使分散均匀，转移至25 mL量瓶，用甲醇分次洗涤容器，洗液转入同一量瓶中，分别加入对照品使测定浓度分别达到待测样品浓度的80%，100%和120%，加甲醇至刻度，摇匀，高速离心，取上清液，进样10 μL，计算回收率，结果见表1。平均回收率100.96%，RSD=1.89%。

图3 3种溶液的高效液相色谱图A.阴性对照品;B.黄芩苷对照品;C.供试品;1黄芩苷

表1 四黄软膏中黄苓苷加样回收率实验结果mg，n=6

2.3.8 精密度实验 取“2.3.3”项同一供试品溶液，连续进样6次依测定法进行测定，记录黄芩苷色谱峰面积，结果RSD为0.55%。

2.3.9 重复性实验 取同一批号样品(批号:20091208)，按“2.3.3”项方法平行制备6份，按上述色谱条件测定。结果黄芩苷的平均含量为2.55 mg·g-1，RSD=1.10% 。

2.3.10 供试液稳定性实验 取“2.3.3”项同一份供试品溶液，室温放置，分别连续6 d测定黄芩苷的峰面积，结果表明，峰面积变化不大，RSD为0.68%，说明样品在6 d内稳定。

2.3.11 3批样品的含量测定 取3批四黄软膏 (批号:20090728，20090914，20091208)，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样分析计算。结果3批样品中黄芩苷含量分别为 2.41，2.65，2.55 mg·g-1。

3 讨论

3.1 TLC展开剂 本实验中黄柏、大黄鉴别中所采用的TLC展开剂分别参见2010年版《中华人民共和国药典》平肝舒络丸及狼疮丸鉴别项下的相关条件。

3.2 供试品溶液制备方法的优选 《中华人民共和国药典》2010年版收载的测定中成药(丸剂、片剂或颗粒剂)中黄芩苷时，采用的溶剂有50%甲醇、70%乙醇或稀乙醇等;提取方法常采用回流或超声的方法。笔者在本研究中考察了不同溶剂、不同提取方法以及不同提取时间对黄芩苷的提取情况，发现软膏辅料及制剂中硫磺对黄芩苷的提取有较大的影响。

3.2.1 提取溶剂的优选 笔者考察了甲醇、甲醇-水(60∶40)和50%甲醇3种溶剂，经超声、回流相同时间后，测定黄芩苷峰面积，依次1 815 242，1 806 010和1 572 742，表明以甲醇或甲醇∶水(60∶40)作为提取溶剂均较好。

3.2.2 提取方法的优选 笔者曾以甲醇为溶剂，考察采用直接超声提取法、水浴回流提取法以及先用少量水分散再超声提取法对黄芩苷的提取的影响。实验结果表明:加入甲醇后振摇，样品保持团块状不易分散;另外可能因本品中含有硫磺，不论是加热还是超声，都易引起样品聚集成团的现象，影响测定，且需60 min以上超声或回流后才能提取完全;如果利用软膏剂中含有较多的表面活性剂，加入少量水略微加热一下，样品就很容易分散，加入甲醇后仍能保持较好的分散状态，此时以及继续分别超声处理10，20和30 min的样品，峰面积基本相同，同时也与回流1 h以上的峰面积一致，说明采用先用少量水分散再加入甲醇混匀后的样品，即使不超声黄芩苷也能较好的提取出来，且操作起来简便，快速。

3.3 流动相的优选 参照2010年版《中华人民共和国药典》双黄连片含量测定项下所用流动相(有机相为甲醇，水相为2%醋酸)，并对水相和有机相的比例进行适当调整，考察其对样品分离度的影响，结果在水相从45%增加至55%，黄芩苷和相邻峰均不能得到很好的分离，当增至60%时，虽然可与相邻峰分开，但峰形不对称。调节水相为1%冰醋酸，并考察不同比例水相和有机相对样品分离情况的影响，结果分离度及峰形均明显改善，分离度达到要求，且峰形对称。最终确定流动相为甲醇∶1%醋酸(60∶40)。

3.4 检测波长的选择 检测波长的选择参照2010年版《中华人民共和国药典》双黄连片和芩暴红止咳片黄芩苷含量测定项下所用波长，其流动相组成相近。

尽管在《中华人民共和国药典》2010年版及一些文献中收载了黄芩苷的含量测定法，但有关在软膏剂中的含量测定的方法报道较少。笔者在研究中发现，由于软膏中含有大量的油相、表面活性剂和水，以及本制剂中含有的硫磺，对黄芩苷的提取影响较大，如果采用常用固体制剂的样品处理方法，难以收到理想的效果。笔者在本实验中根据四黄软膏的特点，对供试品溶液的制备方法进行了改进，方法简便易行，对其他软膏剂的样品处理有一定的借鉴作用。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:554，566，612，638，737.

［2］ 陈毅新，刘杜妙.四黄正骨水的薄层色谱鉴别及微生物限度检查［J］.中国药业，2009，18(12):45-46.

［3］ 杨立伟，龙飞，肖树雄.HPLC法测定消炎清热胶囊中黄芩苷的含量［J］.中国药房，2008，19(21):1632-1634.