CD95/CD95L信号分子介导的细胞凋亡和非凋亡研究进展①

黎小琼 综述 黄宪章 审校 (广东省中医院检验科,广州510120)

CD95/CD95L系统是诱导细胞凋亡的重要途径,在人体自身耐受机制、诱导活化细胞凋亡、控制免疫应答和参与免疫豁免中均起重要的作用。然而近年来新的研究发现CD95/CD95L不仅能够诱导细胞凋亡还可促发多重信号通路抑制细胞凋亡,其表达异常与肿瘤以及某些自身免疫性疾病的发生、发展有着密切联系。

1 CD95、CD95L的分子特征与分布

1.1 CD95 CD95属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)及神经生长因子受体(NGF-R)家族成员的Ⅰ型跨膜蛋白。人CD95基因定位于染色体10q24.1区,包含8个内含子及9个外显子,其基因编码产物分子量约为45 kD。分子结构包括3个部分,即胞膜外的N末端区、跨膜区和胞浆的C末端区。膜外区即信号肽区,其氨基酸序列相对保守且有膜受体特征;跨膜区位于分子结构的中段;胞浆区分为死亡抑制域和死亡结构域,后者在传递凋亡信号中发挥关键性的作用,其氨基酸突变可阻止凋亡信号传导。CD95主要以膜受体的形式存在,人外周血中也有可溶性CD95(sCD95)存在。mCD95与sCD95的区别在于有无跨膜区,sCD95分子是由于异常拼接的转录翻译所致,编码跨膜区的63个碱基对缺失,致使翻译产物缺乏跨膜区而呈可溶性分泌。

CD95为非谱系特征性抗原,广泛表达于胸腺细胞、活化的T和B淋巴细胞、NK细胞及单核细胞等免疫细胞,也可存在于肝、肺等实体组织细胞,以及内皮细胞和多种上皮细胞的表面。

1.2 CD95L CD95L是属于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白,其N末端位于胞浆,C末端位于胞外。人CD95L基因位于染色体1q23上,由5个外显子组成,分子量40 kD。膜结合的CD95L(mCD95L)通过金属蛋白酶介导的蛋白水解作用产生可溶性CD95L(sCD95L),而三聚体形式的 sCD95L才具有功能。sCD95L一方面可作为拮抗剂,与mCD95L竞争结合受体;另一方面通过结合到基质成分而转变成激动剂。sCD95L还具有化学趋化性,可促进中性粒细胞和吞噬细胞迁移。

CD95L主要在活化的T淋巴细胞和NK细胞表面表达,而在巨噬细胞以及睾丸、视网膜和某些肿瘤等非免疫组织中少量表达[1]。

2 CD95/CD95L与细胞凋亡

细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是机体清除感染、变异及衰老细胞并维持自身稳定的主要调节方式。目前认为凋亡主要通过CD95/CD95L系统调控[2]。mCD95L或竞争性抗体激活敏感细胞后,CD95胞质区经过转录后修饰,即半胱氨酸位点的S-亚硝基化[3],致使其死亡结构域相互聚集,形成三聚体并募集到脂筏,三聚体的死亡结构域与适配体(Fas-associated death domain protein,FADD)肽链C端的死亡结构域相连,而FADD肽链N端含有死亡效应结构域,可以集聚胱天蛋白酶8(caspase-8)的酶原,形成凋亡诱导信号复合物(Death-inducing signaling complex,DISC),然后使得caspase-8活化并将凋亡信号向下传递。caspase-8至少可通过两条已知的通路诱导细胞凋亡:(1)直接活化caspase-3;(2)通过凋亡诱导蛋白BID改变线粒体跨膜电位,促进位于线粒体膜间隙的细胞色素c释放到细胞浆内,通过活化caspase-9,致使caspase-3活化。caspase-3为细胞凋亡信号转导中的关键效应酶,其活化最终引发细胞凋亡。该通路还受到细胞型含死亡域的Fas结合蛋白样白介素1β转换酶抑制蛋白(cellular FADD-like interleukin-1βconverting enzyme inhibitory protein,c-FLIP)的负性调控,c-FLIP通过与caspase-8竞争募集到FADD,从而抑制该死亡受体信号通路和caspase-8的活化,但是研究显示c-FLIP在抑制DISC中caspase-8活化的同时导致caspase-8诱导其裂解[4]。

3 CD95/CD95L与非凋亡应答

3.1 CD95/CD95L的非凋亡活性 最近研究显示,sCD95L通过激活CD95后可调节组织再生,促进细胞增殖、迁移和细胞因子的产生,促进自身免疫和肿瘤的发生,表明CD95L亦存在非凋亡活性[5]。

众多研究显示CD95/CD95L系统可促进细胞生长,如CD95可促进鼠肥大细胞成熟,成纤维细胞和成熟的树突状细胞生长及T细胞增殖[6,7]。CD95活化丝氨酸激酶可促进恶性胶质瘤的发展[8];由于CD95L的致瘤活性和缺少凋亡诱导,大量表达sCD95L的小鼠可出现巨大的组织肉瘤[5];许多肿瘤细胞系通过自身分泌CD95L并作用于CD95,进而促进肿瘤的生长[9]。给小鼠注射抗CD95特异性抗体或CD95L可导致抗凋亡信号通路的活化,如Akt,STAT3和NF-κB及抗凋亡因子Bcl-2表达的改变,从而加速局部肝切除术后小鼠的肝脏再生。

“免疫豁免”现象表明炎症反应的发展可被抑制,避免炎症对个别组织完整性和正常功能的破坏,如眼睛的前房、睾丸、胎盘等,其中一个重要的机制是这些组织表达CD95L,诱导CD95+的炎症细胞凋亡。以往认为引进CD95L到移植物中可减少排斥反应,但大量研究发现CD95L并不能对移植物起保护作用。相反,在某些环境中,CD95L可下调中性粒细胞对内皮细胞和上皮细胞的粘附,促进中性粒细胞募集到炎症区域。研究表明T细胞产生大量的CD95L既可以抑制天然T细胞存活,又可以介导非凋亡活性,在表达CD95的组织中诱导炎性因子产生,从而加重疾病[10,11]。

3.2 CD95/CD95L非凋亡应答的相关信号通路 近来,CD95/CD95L非凋亡信号通路备受关注。CD95L的非凋亡活性可促进自身免疫和肿瘤的发生,通过NF-κB通路,MAPK 通路(ERK1/2,p38,JNK1/2)及PI3K通路介导,刺激细胞存活和增殖,促进趋化因子产生和炎症反应,甚至调节细胞的迁移和侵袭[12]。

触发CD95产生存活或死亡的信号取决于刺激的强度[13,14]。CD95诱导的凋亡需要两个具有功能的CD95等位基因才能确保有效的DISC形成,相比之下NF-κB的信号激活阈值明显较低,仅一个具有功能的CD95等位基因也能被激活,此外低浓度抗CD95抗体的刺激并不能促发死亡信号,而是活化MAPK,因此CD95可能通过NF-κB和MAPK 通路,促存活基因表达和诱导致瘤,提示CD95信号的强度对胞内凋亡通路的变化起着重要作用。

这些非细胞毒性级联反应抑制促凋亡通路的同时受配体蛋白和受体内在化的进程调控。CD95胞内区域两个受体位点调节其非凋亡活性,Tyr291促进CD95内在化,Cys199则调节受体聚集及定位到脂筏。CD95L刺激CD95后磷酸化水平提高并定位到脂筏,同时使Akt和ERK磷酸化,且通过CD95L的交联,转录因子NFAT和AP-1活化后导致IFN-γ生成增加,从而促进炎症的发生。

此外,c-FLIP在细胞活化、增殖和分化中也起重要作用[15]。短亚型和长整亚型的FLIP亚型活性不同,后者可聚集肿瘤坏死因子相关因子(TRAF)1、TRAF2、Raf-1及RIP1,从而激活ERK 和NF-κB通路,最终导致细胞增殖及炎症发生。

4 CD95/CD95L与相关疾病

4.1 CD95/CD95L与肿瘤 研究发现在肿瘤细胞中,CD95L的表达增加,而CD95表达下调[6]。各种研究结果显示CD95L激活人肿瘤细胞表面的CD95,诱导趋化因子的产生并最终导致促炎细胞的募集,提示CD95与炎症反应有关,并促进肿瘤生长[14];Chen等[9]对各种人肿瘤细胞、自发或损害诱导卵巢癌和肝癌的小鼠模型进行研究,发现下调或抑制CD95的表达可抑制肿瘤生长,且肿瘤自身分泌的CD95L为其生长所需;Watson等[16]发现在食管腺癌细胞浆中,低水平表达的CD95L可激活MAPK通路,发挥促进肿瘤生长的作用。可见CD95L-CD95信号对肿瘤生长起重要作用。此外,CD95的激活还可促进成胶质细胞瘤的侵袭转移,主要机制为CD95激活后诱导丝氨酸家族成员Yes和PI3K亚基p85的募集从而激活PI3K,而活化的PI3K反向抑制糖原合酶激酶3-β的活性,诱导基质金属蛋白酶的表达,最终提高细胞的侵袭性[8]。基因芯片分析已证实在肿瘤细胞系中潜在大量促肿瘤细胞侵袭的候选基因可被CD95L调控转录,例如尿激酶纤溶酶原激活物和丝/苏氨酸蛋白激酶SNARK。此外,人类肿瘤细胞中CD95死亡结构域失活突变率较高,其失活突变与细胞凋亡信号通路的受阻存在正相关,但它们通常为等位基因的单一点突变,提示不完全突变的基因受体可维持致瘤优势[17]。

4.2 CD95/CD95L与类风湿关节炎 进一步研究发现CD95/CD95L系统在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)的病理过程中至关重要。RA关节中的免疫细胞抵制CD95L介导的凋亡,导致炎症因子聚集及维持炎症过程,并促进骨质破坏[18]。Palao等[19]研究发现刺激CD95后,并依赖caspase的活性和FLIP表达,可活化NF-κB和AP-1,从而增强 RA滑膜细胞的促炎特性,表明FLIP是CD95信号通路凋亡和促炎现象转换的重要分子。阻止胶原诱导关节炎中巨噬细胞CD95-CD95L相互联系可抑制NF-κB活化及IL-1β或脂多糖诱导细胞因子的表达,该机制是通过FADD与Toll样受体(TLR)配体蛋白MyD88的相互作用介导,提示CD95-CD95L相互作用可能通过IL-1受体1或TLR4通路促进慢性关节炎。

4.3 CD95/CD95L与肥大性心肌炎 sCD95、mCD95及CD95L分子通过细胞因子和趋化因子,诱发大量的炎症反应。因此,许多慢性炎症疾病可通过减少这些分子而缓解病情,如心肌炎。许多研究人员在实验模型或人心肌中已证实,CD95的活化可加重炎症并导致心肌肥厚和功能障碍。循环中sCD95L的浓度与已经存在的左心室肥厚有关,亦与左心室重量指数和舒张压呈正相关。

4.4 CD95/CD95L与感染 研究表明由细菌感染引起的额外介质如LPS或肽聚糖等可激活中性粒细胞,促发由活化的CD95介导的非凋亡途径,最终导致细胞因子或趋化因子的分泌和炎症的发生[20]。利用CD95L点突变的gld小鼠制成克氏锥虫感染性心肌炎的模型,可观察到心肌细胞内较轻微的炎症因子浸润,说明CD95L基因的表达与心肌炎有密切的关联[21]。而有研究发现在感染利什曼虫的C57BL/6小鼠中,CD95/CD95L通路参与减轻该虫对自身造成的损害的过程,CD95L和IFN-γ可提高巨噬细胞的活化,导致TNF、IL-6和NO的分泌增多,最终造成对胞内利什曼虫的杀伤。表明CD95L与IFN-γ的协同作用可活化巨噬细胞,通过FCD95/CD95L促发的非凋亡事件有利于控制利什曼虫感染的发病过程[22]。

5 问题与展望

CD95通过调控细胞死亡和存活,可维持机体自身稳定。通过对CD95/CD95L的深入研究,人们重新认识了该系统的生理和病理功能。目前认为,结合不同的因子,CD95信号可诱发不同结果的动态过程。CD95可促进肿瘤细胞的生长,提示抑制CD95的效应而不是促进其活性可作为治疗疾病的研究方向。由于CD95是全身性活化,故针对致病细胞的靶向治疗也将是挑战,此外确定与CD95非凋亡信号通路相关的信号组分,可提供新的靶点。总之,进一步深入探讨CD95系统的具体作用机制,细胞内与临床表现的联系,将为研究肿瘤及类风湿关节炎的发病机制及寻求有效的治疗策略提供方向。

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