核苷(酸)类药治疗慢性乙肝患者HBV逆转录酶区基因耐药的变异分析

徐玲娟，盛秀胜

核苷类似物（NA）抗HBV在临床上已得到广泛应用，但相应的HBV耐药问题也逐渐浮现出来，并成为制约其抗病毒疗效的首要因素[1-2]。由于HBV的逆转录酶没有校对功能，NA相关的HBV耐药变异多发生在多聚酶基因（P）的逆转录酶区（RT）。为此，本研究分析长期核苷(酸)类药治疗慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶区基因变异情况，为临床合理用药及进一步开展耐药机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病例及标本来源 收集2006年1月-2010年3月在金华市中医院就诊的长期核苷（酸）类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本163份，男性标本125份，女性标本38份，患者年龄18～73岁，平均（42±12）岁。其中单用拉米夫定（1amivudine，LAM）66例，阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV）62例，患者口服拉米夫定（0.1 g/d）疗程12～36个月，阿德福韦酯（10 mg/d）疗程24～48个月。LAM和ADV序贯治疗19例，LAM与ADV联合治疗16例，疗程12～36个月。序贯治疗或联合治疗均在患者接受单剂LAM治疗后出现血清HBV DNA反跳至104拷贝/mL以上及（或）生化指标明显改变时使用。所有标本-70 ℃保存备用。

1.2 HBV聚合酶逆转录酶区基因全序列分析 采用QIAamp DNA试剂盒（购自德国Qiagen公司）从血清中提取HBV DNA。用刘宝明等[3]报道的半巢式PCR扩增HBV全长RT区，将PCR产物直接送生工生物工程（上海）有限公司测序。用DNAStar5.0、Vector NTI 13.0等软件分析HBV RT区核苷酸及氨基酸序列，并分别将其与先前报道的突变序列相应位点上的氨基酸比对，筛查分析RT区6个主要的耐药变异位点rtl73、rtl80、rtl81、rt204、rt207和rt236氨基酸耐药变异[4]。

1.3 HBV基因型检测 由于HBV RT区与编码HBsAg的S基因区相互重叠，其核苷酸序列也可决定HBV基因型。为此本研究在RT区基因分析基础上，应用NCBI病毒基因分型工具及MEGA4.0软件对HBV的S基因区核苷酸序列进行系统进化分析，确定HBV基因型。

1.4 统计学处理方法 数据采用SPSSl5．0软件分析，组间比较用卡方检验。

2 结果

2.1 HBV全长RT区基因耐药位点分析 采用半巢式PCR扩增HBV聚合酶逆转录酶区基因，并行测序，结果分析显示，163份慢性乙型肝炎患者血清标本中有64份（占39.26%）发现了已知耐药位点变异。LAM治疗组耐药性变异比例高于ADV治疗组，其中66例单用LAM患者标本有26例（占39.40%），62例单用ADV患者标本有8例（占12.90%）发现已知耐药位点变异。由于LAM和ADV序贯治疗或联合治疗是在患者接受单剂LAM治疗失败后使用，突变位点检测阳性率明显升高。19例LAM和ADV序贯治疗标本有16例（占84.21%）发现耐药位点变异，16例LAM治疗后加用ADV治疗标本有14例（占87.50%）发现耐药位点变异。如表1-4所示，由于治疗药物不同，其耐药位点及发生率也不相同。单用LAM组L180M、M204V/I是最常见的变异，偶有V173L、A18lV、A18lT、A181S及V207I氨基酸位点变异存在，未见N236T变异。与单用LAM组明显不同，单用ADV组主要的变异是N236T和A181T/V变异。LAM和ADV序贯治疗组除外LAM耐药变异特征外，19例序贯治疗患者出现了5例（占26.32%）ADV耐药变异特征：2例N236T+A181V/T、1例N236T、2例A181V，而LAM治疗后加用ADV组未见N236T及A181V/T变异，只是存在较高比例的V173L变异。

表1 单用LAM慢性乙肝患者HBV RT区氨基酸耐药性变异及基因型分析

表2 单用ADV慢性乙肝患者HBV RT区氨基酸耐药性变异及基因型分析

表3 LAM和ADV序贯治疗慢性乙肝患者HBV RT区氨基酸耐药性变异及基因型分析

表4 先用LAM后联合ADV治疗慢性乙肝患者HBV RT区氨基酸耐药性变异及基因型分析

2.2 耐药变异与HBV基因型相关性分析 如表1-4所示，64例存在RT基因耐药位点的患者中，C基因型HBV感染者为19例（占29.69%），B基因型为45例（占70.31%），未检测到其他基因型。B基因型和C基因型比例在单用LAM组、单用ADV组、LAM和ADV序贯治疗组和LAM治疗后加用ADV组间差异无统计学意义（x2=0.421，P＞0.05），B基因型在上述4组的比例分别为69.23%、62.50%、75.00%和71.43%。

3 讨论

LAM、阿德福韦酯等核苷（酸）类似物是目前公认有效的抗乙型肝炎病毒治疗的药物。这类药物在体内与HBV DNA聚合酶底物——三磷酸脱氧核苷竞争，抑制HBV DNA的正常逆转录作用，也可直接整合到病毒DNA链中，形成终止子，使HBV DNA链停止复制，从而发挥较强的抑制病毒复制的作用。在长期抗病毒治疗过程中，HBV出现耐药变异难以避免[4-5]。由于HBV复制能力强，且其逆转录酶缺少校正活性，导致HBV治疗前就存在自发性变异，病毒耐药变异的过程就是药物对病毒变异的选择过程[6]。我们对163例长期服用核苷（酸）类治疗的慢性乙肝患者的RT基因区的变异进行了检测分析， 结果发现，单用LAM 1年以上的慢性乙肝患者RT基因区的变异率达39.40%，单用ADV 2年以上的慢性乙肝患者RT基因区的变异率仅达12.90%，提示ADV耐药的发生率远低于LAM。

目前已发现与LAM耐药相关的主要变异位点是M204V/I（YMDD变异）[4]。M204V/I变异株的复制能力明显下降，其他常与YMDD变异同时出现的变异如M204V/I、L180M、V173L、A181T、V207I，一定程度上能够恢复YMDD变异病毒的复制能力[7-8]。本研究发现，用LAM组存在5例未有M204V/I变异，而存在L180M、A18lV+V207I、V173L+L180M+V207I及A181S氨基酸位点变异。提示，出现这些位点变异的病毒对药物的敏感性并无太大影响，但应具更强的复制能力。由于病例数较少，还需进一步研究。与既往的研究结果一致，ADV主要耐药相关变异为N236T、A181V/T[9]。另外，我们发现，在LAM治疗耐药后合用ADV的患者中，未见ADV耐药相关位点变异（18l及236位），而在LAM和ADV序贯治疗的16例患者中，出现ADV相关位点变异5例，表明序贯治疗后出现LAM和ADV多重耐药的概率明显增加[10]。本研究发现，LAM治疗后加用ADV治疗发现耐药位点变异频率（87.5%）与序贯治疗（84.12%）相当，提示，不管是加药还是换药，均无法逆转原先已经存在的LAM治疗后耐药特征。本结果为临床合理用药及进一步开展耐药机制研究提供了依据。

病毒的基因型反映了HBV自然感染发生变异的特点。基因型分布有地域性，我国以B、C型为主，还有少量A、D型[11-12]。本研究结果显示，64例存在RT基因耐药位点的患者均为B、C型，其中C基因型HBV感染者占29.69%，B基因型占70.31%。王义光等[13]研究显示，87例接受LAM治疗的患者以B基因型为主，但发生耐药变异率较高的是C型。本研究分析单用LAM、单用ADV、LAM和ADV序贯治疗及LAM与ADV联合治疗患者中发生RT基因耐药位点改变的HBV基因型比例，结果显示各组基因型比例差异均无统计学意义，提示长期核苷类似物治疗中HBV耐药变异的发生与基因型无关[14-15]。

[1] Duong A, Mousa SA. Current status of nucleoside antivirals in chronic hepatitis B[J]. Drugs Today (Barc),2009,45(10):751-761.

[2] Zoulim F, Locarnini S. Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues[J].Gastroenterology,2009,137(5):1593-1608.

[3] 刘宝明, 李彤, 董建平,等. A-D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区PCR方法的建立及应用[J].肝脏,2008,13(5):379-383.

[4] Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management[J]. Hepatology,2007,46(1):254-265.

[5] Griffiths PD. A perspective on antiviral resistance[J]. J Clin Virol,2009,46(1):3-8.

[6] Zhang X, Liu C, Gong Q, et al. Evolution of wild type and mutants of the YMDD motif of hepatitis B virus polymerase during lamivudine therapy[J]. J Gastroenterol Hepatol,2003,18(12):1353-1357.

[7] Orlando R, Tosone G, Portella G, et al. Prolonged persistence of lamivudine-resistant mutant and emergence of new lamivudine-resistant mutants two years after lamivudine withdrawal in HBsAg-positive chronic hepatitis patient:a case report[J]. Infection,2008,36(5):472-474.

[8] Ono SK, Kato N, Shiratori Y, et al. The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding-site mutations,increasing hepatitis B virus replication and drug resistance[J]. J Clin Invest,2001,107(4):449-455.

[9] Villet S, Pichoud C, Billioud G, et al. Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure[J]. J Hepatol,2008,48(5):747-755.

[10]Ijaz S, Arnold C, Dervisevic S, et al. Dynamics of lamivudineresistant hepatitis B virus during adefovir monotherapy versus lamivudine plus adefovir combination therapy[J]. J Med Virol,2008,80(7):1160-1170.

[11] 谷鸿喜, 徐子龙, 刘建宇, 等. 多引物对巢式PCR法检测HBV基因型的流行病学分析[J].世界华人消化杂志, 2004, 12(5):1073-1076.

[12] 温志立, 谭德明. 多对型特异性引物巢式PcR检测湖南省乙肝病毒基因型[J]. 世界华人消化杂志, 2004, 12(2):332-335.

[13] 王义光,朱武军,杨兴林.贵阳地区乙型肝炎病毒YMDD变异与基因分型[J].中华肝脏病杂志,2005,13(3):193-195.

[14]Yuen MF, Wong DK, Sablon E, et al. Hepatitis B virus genotypes B and C do not affect the antiviral response to lamivudine[J].2003,8(6):531-534.

[15]Suzuki F, Tsubota A, Arase Y, et al. Efficacy of lamivudine therapy and factors associated with emergence of resistance in chronic hepatitis B virus infection in Japan[J]. Intervirology,2003,46(3):182-189.