胆道闭锁患儿外周血T细胞ITGAL基因启动子区甲基化状态及其mRNA表达

董 瑞 赵 瑞 郑 珊 宋 再 孙 松

胆道闭锁(BA)病因未明，一般认为其发病机制涉及母亲孕期病毒感染、自身免疫介导的胆管破坏及胆道发育异常[1]。随着对自身免疫性疾病的深入研究，发现其与DNA甲基化有着密切的关系，DNA甲基化在维持T细胞功能方面发挥着重要作用，DNA甲基化异常可导致T细胞体外自身反应和体内自身免疫反应[2]。

目前，在自身免疫性疾病中研究较多的是ITGAL基因，其主要编码人功能相关抗原-1 (LFA-1)，是甲基化敏感基因。ITGAL基因DNA低甲基化可导致LFA-1表达升高，且与T细胞自身免疫性密切相关[2]。在BA局部病变组织(肝脏组织和胆管区)中可发现LFA-1表达升高[3～5]，但其在BA患儿外周血中的作用未见文献报道。鉴于ITGAL基因的异常表达与自身免疫性疾病的发生密切相关，本研究分析BA患儿CD4+和CD8+T细胞ITGAL基因启动子区甲基化状态，探讨其与mRNA表达的关系，以期对BA的发病机制有所提示。

1 方法

1.1 BA病例纳入和排除标准 同时满足以下条件的患儿进入本文分析：①复旦大学附属儿科医院(我院)初诊(在外院未予外科干预)，均经我院外科手术后病理学检查诊断为BA的患儿；②日龄<90 d；③除脐疝外，无明显肝外合并畸形；④排除血标本溶血或操作中淋巴细胞损失严重的病例。

1.2 分组设计 进入本文分析的BA患儿分为2组：根据文献报道的样本量要求[6]，本研究预先设定选取5例BA患儿为甲基化结果验证组；余BA患儿为BA组，细胞分离提取DNA和RNA后行ITGAL甲基化水平和mRNA表达分析。另选取我院同期行斜疝手术、日龄≤120 d和肝功能、肾功能正常的患儿为对照组，样本量与BA组1∶1匹配。

1.3 伦理 本研究方案经我院伦理委员会批准，均获得进入研究患儿父母的口头知情同意。

1.4ITGAL基因甲基化水平和mRNA表达分析

1.4.1 细胞分离 纳入患儿均采集静脉血3 mL，淋巴细胞分离液(型号LTS1077，天津TBD公司)常规分离外周血单核细胞(PBMCs)。采用CD4+和CD8+分选磁珠，型号分别为130-045-101和130-045-201(德国Miltenyi Biotec公司)，按说明书操作分离BA组和对照组的CD4+和CD8+T细胞。

1.4.2 DNA和RNA提取 以DNA、RNA共提取试剂盒(北京Tiangen有限公司)提取分离细胞的DNA和RNA。

1.4.3 甲基化水平检测 取DNA约1 μg，按甲基化试剂盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit(北京天漠科技开发有限公司)操作处理。处理过的DNA进行巢式PCR扩增ITGAL基因启动子调控序列近端-250～250 bp目的片段、远端-1450～-950 bp目的片段，引物序列见表1。将胶回收试剂盒(美国Axygen公司)凝胶回收的PCR产物与pMD19-T(日本Takara公司)室温连接2 h以上。取10 μL连接产物转化DH5a感受态细胞，涂布含Amp抗性的LB平板皿，37℃过夜培养。每个平板挑10个克隆进行菌落PCR鉴定。将菌落PCR呈阳性的5个克隆接种于3 mL LB液体培养基中，37℃过夜培养；用质粒小量提取试剂盒(美国Axygen公司)提取质粒，并送测序。测序由上海英俊生物技术有限公司完成。采用CG二核苷酸甲基化状态评估甲基化水平。

1.4.4ITGAL基因mRNA表达检测 采用实时RT-PCR法检测。采用日本TAKARA公司逆转录及荧光定量试剂盒。ITGAL基因及β-actin 引物序列由上海生工技术有限公司设计完成。ITGAL基因(CD11a)上游引物：5′-CACATCTTTCACACTTCCACCA-3′，下游引物：5′-AGCCTT-TACCCTCACAGTTCACT-3′；β-actin上游引物：5′-TCCTTCC-TGGGCATGGAGT-3′，下游引物：5′-CAGGAGGAGCAATGAT-CTTGAT-3′。采用标准曲线相对定量法[7]进行结果分析。

表1 巢式PCR引物序列表

1.5 甲基化结果验证 甲基化结果验证组患儿分离CD4+和CD8+T细胞后，加入含10%胎牛血清、1%双抗的1640培养基及1 μg·mL-1PHA，37℃、5%CO2培养箱培养24 h，取出后等分为2份，其中1份加入5-氮杂胞苷(美国Sigma-Aldrich公司)1 μmol·L-1和IL-2，继续培养72 h；另1份不加5-氮杂胞苷，培养72 h。 按上述方法行甲基化水平和ITGAL基因mRNA表达检测。

2 结果

2.1 一般情况 2010年4～8月于我院初诊并经手术探查病理证实为BA患儿25例进入分析(图1)，其中男10例，女15例，日龄43～90 d，平均日龄(58.0±4.5)d。BA组20例，甲基化结果验证组5例。对照组20例，其中男8例，女12例，日龄51～120 d，平均日龄(65.0±6.7)d。

图1 BA病例纳入流程图

Fig 1 Flow chart of selecting biliary atresia infants

2.2 DNA甲基化水平检测结果 BA组和对照组CD4+、CD8+T细胞ITGAL基因启动子序列-250～250 bp均未发生甲基化(图2)。BA组CD4+T细胞-1450～-950 bp的CG二核苷酸平均甲基化水平显著高于CD8+T细胞，0.94vs0.75，P=0.02(图2A和B)；也显著高于对照组CD4+T细胞，0.94vs0.66，P<0.001(图2A和C)。BA组CD8+T细胞平均甲基化水平与对照组CD8+T细胞差异无统计学意义，0.75vs0.62，P>0.05(图2B和D)；对照组CD4+与CD8+T细胞的平均甲基化水平差异无统计学意义，0.66vs0.62，P>0.05(图2C和D)。

5-氮杂胞苷干预和未予5-氮杂胞苷干预的CD4+、CD8+T细胞ITGAL基因启动子序列-250～250 bp均未发生甲基化(图3)。5-氮杂胞苷干预后CD4+(图3A)和CD8+T细胞(图3B)平均甲基化水平均显著低于未予5-氮杂胞苷干预的水平，CD4+T细胞：0.23vs0.45，P<0.001；CD8+T细胞：0.19vs0.41，P<0.001(图3C和D)。

图2 BA组和对照组CD4+和CD8+T细胞ITGAL启动子区平均甲基化水平

Fig 2 The average methylation levels ofITGALgene promoter in CD4+and CD8+T cells in BA and control groups

Notes A: BA CD4+T cells; B: BA CD8+T cells; C: Control CD4+T cells; D: Control CD8+T cells; In BA subjects, the average methylation level ofITGALgene promoter was higher in CD4+than in CD8+T cells. The average methylation level ofITGALgene promoter in CD4+T cells from infants with BA was significantly higher than that in the control. There were no statistical differences in CD8+T cells between BA and control groups, CD4+and CD8+T cells in control group

图3 5-氮杂胞苷干预对CD4+和CD8+T细胞ITGAL启动子区平均甲基化水平的影响

Fig 3 The average methylation levels ofITGALgene promoter in CD4+and CD8+T cells in 5-azaC treated and untreated groups

Notes A: CD4+T cells (5-azaC untreated); B: CD4+T cells (5-azaC treated); C: CD8+T cells (5-azaC untreated); D: CD8+T cells (5-azaC treated). The average methylation level ofITGALgene promoter was significantly reduced in the treated cells compared with the untreated cells (P<0.05)

2.3ITGAL基因mRNA表达 BA组外周血CD4+T细胞ITGAL基因mRNA的表达显著低于CD8+T细胞(0.021±0.002vs0.032±0.004，P=0.013)，也显著低于对照组CD4+T细胞(0.021±0.002vs0.031±0.003，P=0.007)。BA组CD8+T细胞ITGALmRNA表达与对照组CD8+T细胞差异无统计学意义(0.032±0.004vs0.034±0.006，P=0.266)；对照组CD4+与CD8+T细胞ITGALmRNA表达差异无统计学意义(0.031±0.003vs0.034±0.006，P=0.227)。

5-氮杂胞苷干预的CD4+和CD8+T细胞ITGALmRNA的表达均显著高于未予5-氮杂胞苷干预的水平(CD4+T细胞：0.016±0.002vs0.006±0.002，P=0.013；CD8+T细胞：0.015±0.002vs0.006±0.001，P=0.025)。

3 讨论

BA是新生儿胆汁淤积的常见病因，以肝内和肝外胆管进行性炎症及纤维化为主，其病因复杂。同卵双胎儿并不同时发展为BA，提示非遗传性因素在BA的形成中起重要作用[8]。DNA甲基化是一种重要的调控转录的表观遗传机制。基因组DNA甲基化状态改变会造成染色体不稳定或基因表达异常[9,10]。

人ITGAL基因定位于16p11.2，基因编码CD11a，编码LFA-1。LFA-1是β2家族整合蛋白，为α链CD11a 和β链 CD18 组成的异二聚体，局限在白细胞上表达，具有细胞黏附和共刺激信号作用，参与免疫细胞的发育、分化、免疫应答和调节[11,12]。LFA-1缺乏会导致对炎症反应能力下降，同时增加机体对感染性疾病的易感性[13,14]。而其高表达则可降低T细胞激活所需的抗原阈值，促进T细胞自身反应性激活，而且可介导T细胞黏附，促进T细胞向靶器官聚集[15]。本研究发现编码的LFA-1的ITGAL基因mRNA在BA患儿外周血CD4+T细胞中表达水平降低。由此，推测BA患儿中LFA-1的低表达可使机体增强对病毒的易感性，增加了BA发病的风险。既往报道BA患儿肝脏组织和胆管上皮ITGAL基因表达升高，提示LFA-1在胆道局部自身免疫反应中起重要作用；而造成外周血和肝脏局部表达不同的原因，则可能是由于BA肝脏及肝外胆道中LFA-1配体(主要是ICAM-1)的高表达，导致这些细胞定向的向肝脏局部归巢，并介导针对胆道上皮的自身免疫反应，故外周血中T细胞LFA-1表达下降。

有研究表明LFA-1为甲基化敏感免疫相关基因，其表达可能与其启动子区甲基化状态相关[16]。本研究对BA组与对照组的CD4+和CD8+T细胞的ITGAL基因启动子区甲基化状态进行检测，结果发现BA组较对照组CD4+T细胞的ITGAL基因启动子区处于相对高的甲基化状态；BA组CD8+T细胞的ITGAL基因启动子区也处于类似的高甲基化状态，但与对照组比较差异无统计学意义。有两方面原因：①可能由于BA 主要是CD4+Th1细胞所介导的自身反应过程，同时作为CD4+T细胞的Th2 和Th17细胞亚群亦在BA的病理变化中发挥重要作用[17～19]；②LFA-1可调节Th1/Th2/Th17 CD4+T细胞亚群间的平衡状态，调控自身免疫性疾病的发生[20]。另外，本研究发现BA患儿CD4+T细胞的ITGAL基因启动子区处于相对高的甲基化状态，不同于其他自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)中的低甲基化状态[21]。考虑可能与BA的发病因素较为复杂，或可能是受其他表观遗传因素(如乙酰化、磷酸化、泛素化及苏素化等[22,23])的影响，值得进一步深入研究。

5-氮杂胞苷是核苷类DNA甲基化转移酶抑制剂，其机制是核苷类似物转变成脱氧核苷三磷酸，代替胞嘧啶进入复制的DNA分子。这些物质只在细胞S期具有活性，具有很强抑制DNA甲基化的作用。DNA甲基转移酶结合在被修饰DNA分子的碱基上，形成去甲基化的DNA分子。本研究采用5-氮杂胞苷干预T细胞，比较干预与否对ITGAL甲基化水平和mRNA表达的影响。结果显示，使用5-氮杂胞苷干预后，CD4+和CD8+T细胞ITGAL基因启动子区域甲基化水平降低，mRNA表达升高，反证了未予5-氮杂胞苷干预的ITGAL基因调控序列出现了高甲基化，导致mRNA表达下降。有研究指出，CD4+和CD8+T细胞ITGAL基因启动子区甲基化水平降低可能导致ITGAL基因转录增加，进而引起ITGAL基因表达增加，这种调控可能发生在转录水平[24～26]。

结论：本研究提示，BA患儿CD4+T细胞ITGAL基因启动子区存在高甲基化状态，可能是造成宿主对病毒易感性增加的主要因素。

本研究的不足之处：①由于研究时间较短，纳入的样本量较局限；②CD4+和CD8+T细胞有许多不同的亚群，可能会对实验结果造成一定影响；③不能说明乙酰化、磷酸化、泛素化及苏素化等因素是否也对BA基因起调控作用。

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