广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体水平调查

邝 璐 王长兵 梁卓夫 钟家禹 肖密丝 朱 冰

1995年，中国首次从手足口病(HFMD)患者分离出肠道病毒71型(EV71)，至2008年全国范围内数次出现EV71导致的HFMD暴发疫情，并有死亡病例的报道。因此，中国卫生部于2008年5月将其列为丙类传染病[1]。EV71感染人体后，首先在体内产生IgM抗体，其在体内持续的时间较短，随后会产生IgG抗体，该抗体可在体内存在较长时间。IgG抗体可产生对同型病毒的持久免疫，检测血清中EV71-IgG抗体能够反映该病毒在人群中的流行特征和个体既往感染情况。因此抗体检测对于了解EV71的传播特征具有重要的意义。国内外在EV71病原学和分子生物学方面已有深入研究，但对EV71抗体水平调查尚无详细的研究报道。本研究拟通过检测健康儿童血清EV71-IgG抗体水平，以了解广州地区不同年龄健康儿童EV71-IgG抗体阳性率的情况，并分析与EV71感染HFMD发病的关系。

1 方法

1.1 EV71的来源与分型 来源于本实验室从HFMD患儿分离到的标本，参照GenBank上EV71基因组设计分段扩增引物，进行RT-PCR分段扩增EV71基因组，PCR产物直接进行序列测定，采用ClustalW/X、DNASTAR、MEGA 4.1等软件分析基因组序列，构建EV71的全基因组进化树后，显示与C4亚型的分离株明显分在一组(另文待发表)，因此本研究分离到的EV71株为C4亚型。

1.2 EV71 C4型IgG抗体检测方法的建立

1.2.1 EV71诊断抗原制备 ①RD细胞(购于中国科学院上海细胞库)接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO公司)培养，待细胞长至80%时，接种EV71，当细胞病变效应(CPE)达到75%后收获(2～3 d)，将细胞培养的病毒反复冻融3次；②将冻融后的病毒在4℃、12 000g离心1 h，去除细胞碎片；上清再经过0.22 μm过滤器过滤，保存滤液；③病毒滤液36 000g离心，收集沉淀物，沉淀物用10 mmol·L-1PBS溶解；④采用连续密度梯度法纯化病毒，用氯化铯调比重至重量体积比为1.34 g·mL-1，38 000g离心24 h，收集蛋白条带。蛋白条带用10 mmol·L-1PBS稀释10倍，38 000g离心4 h，再用10 mmol·L-1PBS溶解沉淀物，即为EV71纯化物；⑤病毒鉴定：将EV71纯化物用磷钨酸进行染色，铜网固定后在电镜下进行观察。

1.2.2 EV71-IgG抗体诊断试剂盒建立方法

1.2.2.1 试剂盒生产工艺 ①抗体微孔板制备：包被缓冲液选择50 mmol·L-1(pH 9.6)碳酸钠缓冲液，EV71纯化物稀释为5 μg·mL-1，每孔加入100 μL包被酶标板，4℃过夜。取出后甩干，10 mmol·L-1PBS洗涤1遍，每孔加入封闭液[1%牛血清白蛋白(BSA)，5%NBS，3%蔗糖，10 mmol·L-1PBS等]150 μL，置4℃冰箱中过夜。直接甩掉封闭液，37℃烘干2 h，封板4℃保存备用。②羊抗人IgG辣根过氧化物酶(Sigma公司)，用酶标稀释液[1%BSA、0.5%明胶、0.1%酪蛋白、0.1% 氨基比林、0.1% Proclin-300、10 mmol·L-1PBS(pH 7.2)]将抗体酶稀释至工作浓度，分装至酶标瓶中。③抗体稀释液配制：配方为0.5%BSA、10 mmol·L-1PBS和0.1% Proclin-300，分装到瓶中。④显色液、终止液配制：显色液A配方为0.005%双氧水和0.1 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)，显色液B配方为2.5 mg·L-1四甲基联苯胺(TMB)和无水乙醇。终止液为2 mol·L-1硫酸。

1.2.2.2 试剂盒检测方法 采用ELISA间接法检测EV71-IgG抗体。在微孔条上包被纯化的EV71抗原，检测时将待检血清样本用血清样本稀释液1∶100进行稀释，吸取100 μL稀释物加入微孔条中，37℃温育30 min，洗板5遍后加入羊抗人IgG辣根过氧化物酶工作液100 μL，37℃温育30 min，洗板5遍后加入底物A和B各50 μL，37℃显色10 min，加入终止液50 μL，用酶标仪450 nm/630 nm双波长读值判定结果。

1.2.2.3 试剂盒临界值判断 采用细胞中和实验方法[2]，筛选出150份EV71-IgG抗体阴性血清，采用本试剂盒检测，绘制ROC曲线，以YOUDEN指数最大所对应的A值作为临界值。

1.2.2.4 试剂盒实验室评价 采用细胞中和实验方法，筛选出EV71阳性血清20份、EV71阴性血清100份、柯萨奇A16病毒抗体阳性血清5份。用本试剂盒检测上述血清。

1.3 健康儿童血清EV71-IgG抗体分析 收集2010年1～3月在广州市妇女儿童医疗中心(我院)儿保科抽血进行常规保健检测的剩余血清标本，筛选出无发热、无HFMD症状的健康儿童血清标本，-20℃保存备用。采用EV71-IgG抗体诊断试剂盒检测血清标本，结果以阳性和阴性表示。

1.4 HFMD患儿EV71检测 对符合卫生部《手足口病诊疗指南2010年版》确诊的我院2010年全年门诊及住院HFMD患儿，取患儿咽拭子标本采用实时荧光PCR检测方法[3]进行EV71特异性核酸检测。

1.5 分组 健康儿童和HFMD患儿均分别依年龄分为<1岁、～2岁、～3岁、～4岁、～5岁和～14岁组。

1.6 统计学方法 EV71-IgG阳性率的年龄和性别差异采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义，采用SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 EV71纯化物电镜分析 EV71颗粒直径约为26 nm(图1)，与文献[4]描述一致。

图1 EV71纯化物电镜图片

Fig 1 Photo of purified EV71 virus under electron microscope

2.2 EV71-IgG试剂盒临界值确定 以150份EV71-IgG抗体阴性血清的A值绘制ROC曲线，结果显示，本研究设定的临界值为0.148。血清样本A值≥0.148判为EV71-IgG抗体阳性，<0.148则判为阴性。

2.3 EV71-IgG试剂盒实验室评价 结果显示，本研究建立的试剂盒可检测出阳性血清20份，与细胞中和实验方法阳性符合率为100%；可检测出阴性血清92份，与细胞中和实验方法阴性符合率为92%；与柯萨奇 A16病毒抗体无交叉反应。

2.4 健康儿童不同年龄和性别血清EV71-IgG阳性率比较 2010年1～3月获得819名健康儿童血清标本，其中男481名，女338名。表1所示，<1岁组EV71-IgG抗体阳性率最高，此后逐渐下降并维持在较低水平。各年龄组EV71-IgG抗体阳性率两两比较显示，<1岁组EV71-IgG抗体阳性率显著高于其他各组(均P<0.05)；～2岁组EV71-IgG抗体阳性率显著高于～3岁、～4岁、～5岁和～14岁组(均P<0.05)。～3岁，～4岁，～5岁和～14岁组EV71-IgG阳性率差异均无统计学意义。各年龄组EV71-IgG抗体阳性率未见显著性别差异(P>0.05)。

2.5 HFMD患儿EV71检测结果 2010年我院确诊病例EV71特异性核酸检测阳性HFMD患儿的咽拭子标本4 780例，其中男3 070例，女1 718例。 EV71阳性率各年龄组分布，<1岁310例(6.5%)，～2岁1 157例，(24.2%)～3岁1 337例(28.0%)，～4岁1 094例(22.9%)，～5岁450例(9.4%)，～14岁432例(9.0%)。

表1 819名健康儿童各年龄组血清EV71-IgG阳性率(n/N)

Tab 1 Positive rate of EV71-IgG in different age groups in 819 normal children

Agegroup/yPositivemales/totalmalesPositivefemales/totalfemalesPositive[n(%)]<1(n=100)31/5729/4360(60.0)-2(n=183)42/10630/7772(39.3)-3(n=116)11/684/4815(12.9)-4(n=140)27/9111/4938(27.1)-5(n=113)9/647/4916(14.2)-14(n=167)25/9513/7238(22.8)

Notesχ2test analysis showed that in age group 0 to 1 EV71-IgG positive rate was significantly higher than other groups (χ2was 11.65, 52.49, 26.07, 48.58 and 37.35, respectively,P<0.05); among the age groups of 2 to 3 years old, 3 to 4 years old, 4 to 5 years, and 5 to 14 years old, the EV71-IgG positive rate's differences were not statistically significant. The binomial distribution analysis showed that there was no gender difference in the positive rate of all age groups between the six age groups (P> 0.05)

2.6 健康儿童血清EV71-IgG抗体阳性率与EV71阳性年龄构成比的相关性趋势 图2所示，3岁前EV71-IgG抗体阳性率与EV71阳性年龄构成比呈相反趋势，4～14岁呈相同趋势。<1岁组EV71-IgG抗体阳性率最高，而EV71阳性年龄构成比最低；～3岁组EV71-IgG抗体阳性率最低，而EV71阳性年龄构成比最高。

图2 健康儿童各年龄组血清EV71-IgG阳性率与EV71阳性年龄构成比相关性

Fig 2 The relationship between EV71-IgG positive rates and EV71 positive rates in different age groups in healthy children

3 讨论

自从2008年3月中国安徽省暴发HFMD疫情以来，全国各地都出现HFMD的暴发流行[5～7]。2008年，广州地区HFMD的主要病原是EV71(63.6%)[3]。由于EV71引起的HFMD会进一步发展为无菌性脑膜炎、重症脑膜炎，甚至死亡。因此对EV71的研究受到国内外学者的重点关注[8～10]。本实验中用于包被的病毒抗原为临床分离，经过基因测序为EV71 C4亚型，这与中国疾病预防控制中心2008年5月发布的中国EV71流行的亚型相同。本实验采用纯化全病毒作为抗原包被建立ELISA间接法检测血清中的EV71-IgG，可提高检测的敏感度和特异度。该抗原保留了天然抗原所具备的抗体结合特性，所有的抗原决定簇包括立体构型决定簇都不会受到破坏，保证了反应的特异性。本实验与细胞中和实验方法阳性符合率为100%，阴性符合率为92%，与柯萨奇 A16病毒抗体无交叉反应。提示，本研究建立的试剂盒基本可应用于健康儿童血清EV71-IgG抗体分析。

通过对健康儿童各年龄组血清EV71-IgG抗体阳性率比较，结果显示～1岁组血清EV71-IgG抗体阳性率显著高于其他各年龄组，考虑该年龄组与外界接触机会较少，提示较高的EV71-IgG抗体可能来自于母体[10]；之后抗体阳性率呈下降趋势，提示母传途径获得的EV71-IgG抗体逐渐消失。

本研究还对2010年确诊EV71感染的HFMD患儿进行分析，结果显示，<1岁EV71阳性年龄构成比最低(6.5%)，而EV71-IgG阳性率最高(60.0%)，提示EV71-IgG母传抗体可能对HFMD的发病保护作用强；～2岁组EV71阳性年龄构成比39.3%，同年龄组EV71-IgG阳性率24.2%逐渐接近，～3岁组和～4岁组EV71阳性年龄构成比处于较高水平(22.9%和28.0%)，提示为HFMD的高峰年龄，而该年龄组的EV71-IgG抗体阳性率处于较低水平(12.9%和27.1%)，提示缺少EV71-IgG抗体的保护，可能是导致HFMD高发的原因之一。

综上表明，5岁以下的儿童是感染EV71的主要人群,而且该年龄组的儿童大多与外界有密切接触，集中在托幼机构，EV71极易通过日常接触、玩具和其他教学用具传播。因此该年龄组的儿童是EV71防控的重点对象。目前在没有特效治疗HFMD的药物和预防EV71的疫苗时，应根据EV71的流行特点进行防控，要点是控制传染源，切断传播途径。此外，加强EV71疫苗的研制，以提高1～5岁EV71易感人群的保护性抗体水平是目前亟待解决的问题。

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