少孢节丛孢菌新疆分离株丝氨酸蛋白酶全长基因的克隆及生物信息学分析

王俊伟，孟庆玲，乔军，王为升，罗建勋，才学鹏，赵春光

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州730046）

少孢节丛孢菌新疆分离株丝氨酸蛋白酶全长基因的克隆及生物信息学分析

王俊伟1，孟庆玲1，乔军1，王为升1，罗建勋2，才学鹏2，赵春光1

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州730046）

根据已经报道的少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术对少孢节丛孢菌新疆分离株（XJ－XA）丝氨酸蛋白酶（命名为Aoz1）基因序列进行了扩增，并与国内外少孢节丛孢菌不同地域分离株相应序列进行了同源性分析，构建该基因系统进化树。结果显示，XJ－XA Aoz1基因全长为1344bp，包含2个外显子和1个63bp的内含子（第517～579位核苷酸），编码426个氨基酸。Aoz1的信号肽位于氨基酸序列的第1～21位氨基酸；氨基酸序列的第160～171位、200～210位和351～361位分别是天冬氨酸（D）、组氨酸（H）和丝氨酸（S）活性位点所在区域，表明该酶属于Subtilase家族；该酶还含有2个潜在的N末端糖基化位点及2个与底物结合的S1区。系统发生分析发现，少孢节丛孢菌不同地域分离株Aoz1基因序列具有较高的亲缘性，与其他捕食线虫性真菌Aoz1基因亲缘性较远。本研究为研发家畜线虫病生物防控制剂奠定了前期基础。

少孢节丛孢菌；丝氨酸蛋白酶；基因克隆；生物信息学

捕食线虫性真菌是杀线虫性真菌中的一类以营养菌丝特化形成的捕食器（黏性菌丝、粘性菌网、黏性分枝、黏性球、收缩环、非收缩环和冠囊体等）捕捉线虫的真菌［1－2］，主要包括节丛孢属（Arthrobotrys Corda）、隔指孢属（Dactylella Grove）和单顶孢属（MonacrosporiumOudermans）等种类。近几十年来，丹麦等国开展用捕食线虫性真菌对动物寄生虫病进行生物防控的研究，筛选出了适合本国实际作用良好的菌株，并在生产实践中进行了杀灭寄生性线虫的试验，取得了理想的效果。其中，丹麦已申报了国际专利，并进行了商品化开发与推广试验研究。

近年来，人们对真菌捕食线虫的分子机制有了较深入研究，先后发现并克隆了一些真菌侵染线虫的相关基因［3－6］，这为研发预防动物消化道线虫的生物防控制剂奠定了一定的基础［7－9］。新疆的微生物资源丰富，某特有的生态环境使得一些微生物具有独特的生物学特性。本研究在分离多株具有强捕食线虫活性真菌的研究基础上，利用PCR技术对少孢节丛孢菌新疆分离株丝氨酸蛋白酶（Aoz1）的编码基因进行扩增、克隆和测序，通过分子生物学软件对不同种类真菌的Aoz1基因序列进行比较分析，了解该基因在不同种属菌株间的同源性和相关分子信息，旨在为下一步进行该功能性基因的异种表达和对少孢节丛孢菌重组菌构建奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

捕食线虫性真菌－少孢节丛孢菌新疆分离株（Arthrobotrys oligospora XJ－XA）由石河子大学动物科技学院寄生虫学实验室提供。GPYA培养基由本研究室自配（15g葡萄糖，2g蛋白胨，5g酵母提取物，加蒸馏水定容至1L）。Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自上海生物工程公司，pMD18－T载体和200bp DNA Ladder Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的提取

将少孢节丛孢菌新疆分离株（Arthrobotrys oligospora XJ－XA）接种于GPYA培养基中，在20±1℃霉菌培养箱中培养1周。取适量的菌丝，然后按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行提取少孢节丛孢菌的DNA。

1.2.2 引物设计与合成

根据GenBank中发表的相关基因序列，采用Premier 5.0引物软件设计少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶编码序列的特异性引物：

上游引物 Aoz1－f：5′－ATGCTTACGAACGGCCTCATCTC－3′；

下 游 引 物 Aoz1－r：5′－CTAGCTAGCAACAATCGCGACTTGGTG－3′。

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。将合成的引物进行低温瞬时离心，加入灭菌三蒸水配成100 μm储备液，于－20℃保存，使用时稀释为25μm。

1.2.3 PCR扩增反应体系的建立及反应条件

总反应体系为50μL，体系成分：取提取的DNA模板 2μL，10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol／L dNTPs 4μL，Aoz1－f（25μm／L）、Aoz1－r（25μm／L）各1μL，d3H2O 36.8μL，Taq DNA聚合酶（5U／μL）0.2 μL混匀。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性40 s，54℃退火40s，72℃延伸150s，36个循环；72℃延伸10min。最后降温至4℃保存。

1.2.4 Aoz1基因的克隆

将PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，并设Marker和阴性对照，以检测其纯度及碱基序列长度。电泳完成后，小心取出胶板，置于电泳凝胶紫外成像仪中，观察拍照。对扩增得到的PCR粗产物再用回收试剂盒进行纯化回收。将纯化回收片段和载体pMDl8－T连接过夜，次日转化感受态细胞E.coli DH5α，在氨苄青霉素平板上进行筛选，然后做菌落PCR反应进一步筛选验证。

1.2.5 序列测定与分析

将验证正确的重组载体产物送至生工生物工程（上海）有限公司直接测定核苷酸序列。利用生物在线分析软件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／，http：／／www.expasy.org／tools／）对丝氨酸蛋白酶Aoz1中存在的信号肽、结构域、氨基酸活性位点等进行分析，并应用MEGA5.0等软件对新疆分离株和GenBank中发表的捕食线虫性真菌及相关菌株的丝氨酸蛋白酶基因序列进行分析，并采用NJ法（Neighbor－Joining Method）构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

利用特异性引物扩增出Aoz1基因序列，再经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，所扩增的目的PCR产物的分子量约1344bp（图1）。克隆转化后，随机挑取单菌落，做菌液PCR筛选验证，成功得到阳性转化子（图2）。

图1 丝氨酸蛋白酶Aoz1基因PCR扩增结果Fig.1Amplification product test results of serine protease Aoz1gene by PCR

图2 丝氨酸蛋白酶Aoz1基因阳性克隆菌落PCR扩增结果Fig.2Amplification product test results of positive transformants of serine protease Aoz1gene of Arthrobotrys oligospora XJ－XA by colony PCR

2.2 丝氨酸蛋白酶基因核苷酸及氨基酸序列生物信息学分析

经测序，Aoz1基因全长1344bp（此序列已经提交GenBank，登录号为JF747254），该序列由1个开放阅读框（ORF）组成，含有2个外显子和1个内含子。内含子位于Aoz1基因的第517～579位核苷酸，大小为63bp，以GT开头，AG结尾，具有真菌内含子的共同特征。用DNAMAN软件翻译所得序列编码区得到蛋白质氨基酸序列（图3）。

图3 少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因和氨基酸序列Fig.3Nucleotide sequence and amino acids sequence of serine protease of Arthrobotrys oligospora

由图3可知，序列中含有426个氨基酸；进一步经同源性分析得知：翻译后氨基酸序列与GenBank中发表的少孢节丛孢菌的PII蛋白酶的氨基酸序列同源性为97.67%，与少孢节丛孢菌中性丝氨酸蛋白酶氨基酸序列的同源性为97.89%。与其他蛋白酶同源性比对显示，Aoz1为典型的丝氨酸蛋白酶。Aoz1丝氨酸蛋白酶含有的信号肽位于序列的第1～21位，包含起始密码子甲硫氨酸（M）、1个由8个氨基酸残基（Leu－Leu－Ala－Ile－Ala－Gly－Leu－Ala）组成的疏水中心以及在信号肽酶酶切位点之前的3个疏水残基（Ala－Phe－Ala）。Aoz1前肽切割位点在分泌性蛋白的N末端之前，且前肽的最后1个氨基酸残基是位于序列第123位的酪氨酸（Y）；氨基酸序列的第160～171位、200～210位、351～361位分别是天冬氨酸（D）、组氨酸（H）、丝氨酸（S）活性位点所在区域，表明该酶属于Subtilase家族。成熟的Aoz1丝氨酸蛋白酶序列包括303个氨基酸，分子量为31.4kDa，分子式为C1364H2129N389O454S6，等电点理论值为5.97；它还包括2个潜在的N末端糖基化位点（Asn178、Asn252）及与底物结合的S1区（SBP）Ser259Leu260Gly261和 Ala285Ala286Gly287（图4）；而且高度保守的Asn288在维持反应中间物的稳定性方面起着关键性作用。

图4 Aoz1基因的内含子／外显子和基本特征的模式图Fig.4Diagram of Aoz1gene showing the presence of intron／exons and basic features

2.3 少孢节丛孢菌XJ－XA株丝氨酸蛋白酶Aoz1的二级结构预测

利用SOPMA在线软件对少孢节丛孢菌新疆分离株XJ－XA的丝氨酸蛋白酶Aoz1进行蛋白质二级结构预测（图5）。预测Aoz1蛋白的二级结构包括426个氨基酸，其中115个氨基酸（占27.00%）可能形成α－螺旋（h），95个氨基酸（占22.3%）可能形成延伸链（e），189个氨基酸（占44.37%）可能形成无规卷曲（c），27个氨基酸（占6.34%）可能形成β－转角（t），但没有形成β－折叠片。由此可知该蛋白质主要以α－螺旋、延伸链及无规卷曲为主。

图5 利用SOPMA在线软件预测的少孢节丛孢菌新疆分离株XJ－XA丝氨酸蛋白酶的二级结构Fig.5Predicted secondery structure of serine protease Aoz1of A.oligospora XJ－XA by using SOPMA secondary structure prediction method

2.4 少孢节丛孢菌XJ－XA株与世界不同地域分离株同源性比较

用DNAStar中的Clustal V软件对测序所得的少孢节丛孢菌新疆分离株XJ－XA丝氨酸蛋白酶基因序列与GenBank中发表的丝氨酸蛋白酶基因编码序列进行分析，少孢节丛孢菌新疆分离株（A.oligospora XJ－XA）丝氨酸蛋白酶基因序列与A.oligospora国外株丝氨酸蛋白酶基因、A.oligospora中性丝氨酸蛋白酶基因、A.multisecundaria丝氨酸蛋白酶基因、弯孢节丛孢菌（A.musiformis）丝氨酸蛋白酶基因、云南节丛孢菌（A.yunnanensis）丝氨酸蛋白酶基因的相似性分别为97.5%、98.3%、76.8%、81.9%和74.6%；同时发现属内种间和种内株间相似性相差较大。

2.5 少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因的遗传进化分析

借助MEGA5.0软件包对新疆分离株（XJ－XA）和GenBank中发表的其他捕食线虫性真菌及相关菌株的丝氨酸蛋白酶基因序列绘制了进化树（图6）。从进化树图上可以看出：来源于食线虫性真菌和昆虫病原真菌的丝氨酸蛋白酶聚成2个分枝，由共同祖先进化而来。来自捕食线虫性真菌的丝氨酸蛋白酶（XJ－XA Aoz1、Mc1、Aoz1、Ac1、Dv1、Ds1、Mlx、PII和SPR1等）较有规律的按捕食结构的不同排列于进化树上并形成第一个分枝；来自内寄生性真菌和昆虫病原性真菌的丝氨酸蛋白酶（Pr1、PrA、PrK、Psp－3、VCP1和 Ver112）也依次分别较早地聚于一起并形成第二个分枝。但值得注意的是，Monacrosporium haptotylumSPR2经核苷酸序列比对存在几个较大碱基变异区，变异程度较大，在进化树上单独形成第三个分枝，其分类还有待商榷。在进化树图上，XJ－XA与A.oligospora国外株、A.oligospora云南分离株较早地聚为一枝，亲缘关系最近，而与隔指孢属和单顶孢属在遗传距离上相对较远，符合根据捕食器结构和分生孢子等形态特征进行分类的结果，也说明基于功能性基因的分子生物学信息可以在一定程度上反映捕食线虫性真菌的分类关系，但功能性基因能否作为分类的依据还有待商榷。

图6 采用NJ法基于Aoz1基因所做的捕食线虫性真菌的系统发生分析Fig.6Phylogenetic analysis of nematode－trapping fungi based on Aoz1gene with Neighbor－Joining（NJ）Method

3 讨论

根据捕食器类型，捕食线虫性真菌分成两种，一种是套捕型捕食线虫性真菌，代表种为少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora），可产生菌环、粘性菌网等捕食器，以套捕方式捕食线虫幼虫。另一种是粘捕型捕食线虫性真菌，代表种为纺锤隔指孢菌（Dactylella ellipsospora），可形成菌结等捕食器，以粘捕的方式捕食线虫幼虫［10－11］。捕食线虫性真菌的捕食过程可分为吸引、识别和黏附、侵染、消解几个过程［11－12］。捕食线虫性真菌在捕食线虫时，首先在线虫诱导下形成捕食器，捕食器再吸引寄主线虫并与线虫发生特异性识别，进而将线虫粘着，然后在较短时间内侵入线虫，并于侵入后萌发产生普通营养菌丝，同时分泌一些水解酶－－胞外酶，尤其枯草杆菌蛋白酶（Subtilisin）样丝氨酸蛋白酶，最终将线虫消解。在侵染线虫过程中，捕食线虫性真菌借助机械压力和分泌的胞外酶的联合作用［13］，促进菌丝对线虫体壁的直接穿透，而其中胞外酶起主导作用。在胞外酶中，Subtilisin样丝氨酸蛋白酶是一种作为毒力因子的酶类，以具有天冬氨酸（D）－组氨酸（H）－丝氨酸（S）催化三联体为特征，是许多真菌侵染线虫的一种关键酶［12－13］。

在本研究中，少孢节丛孢菌新疆分离株丝氨酸蛋白酶核苷酸序列推导的氨基酸序列与同种国外株和云南分离株的相似性分别为97.67%和97.89%，证实我们的分离株确实属于少孢节丛孢菌（A.oligospora），扩增所得的核苷酸序列为少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶的基因序列。本次试验扩增所得的少孢节丛孢菌XJ－XA株丝氨酸蛋白酶基因序列为1344bp，与同种国外分离株和云南分离株的同源性分别为97.5%和98.3%。系统发生分析发现，少孢节丛孢菌（A.oligospora）新疆分离株 XJ－XA丝氨酸蛋白酶基因和瑞典株及云南分离株3株菌聚为一枝，与隔指孢属和单顶孢属在遗传距离上相对较远，这与基于捕食器结构和分生孢子等形态特征进行分类的结果相一致。研究还发现，少孢节丛孢菌不同分离株丝氨酸蛋白酶之间存在差异，说明少孢节丛孢菌在不同国家和地区存在不同的株，其生物学特性可能也存在差异。

动物线虫病是严重危害畜牧业发展的大敌，不仅造成了巨大的经济损失，而且应用化学驱虫药物已产生抗药性、药物残留对人体的危害和生态环境污染等应给予高度重视的问题。因此，研发捕食线虫性真菌及其侵染线虫的生物制剂来控制家畜的线虫病具有重要的意义［14－15］。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of Full－Length Gene of Serine Protease of Arthrobotrys oligospora Xinjiang Isolate

WANG Junwei1，MENG Qingling1，QIAO Jun1，WANG Weisheng1，LUO Jianxun2，CAI Xuepeng2，ZHAO Chunguang1
（1Department of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046，China）

According to the previously reported sequences of serine protease of Arthrobotrys oligospora，the serine protease（designated Aoz1）sequence of A.oligospora Xinjiang isolate（XJ－XA）was amplified with designed specific primers by PCR and a phylogenetic tree was constructed corresponding to sequence identity analyses of domestic and overseas isolates of Arthrobotrys oligosporafrom different geographic regions.The results showed that the Aoz1gene of XJ－XA strain contains 1344base pairs with one intron of 63－bp and two exons encoding apolypeptide of 426amino acid residues.Aoz1has a signal peptide of 21－amino acid consisting of the initial methionine，position 1～21in Aoz1，and the protease had the aspartic acid （Asp164）－histidine（His203）－serine（Ser353）（in Aoz1）catalytic triad as active sites，which confirmed that Aoz1belongs to the subtilisin－like serine protease family.Moreover，Aoz1contains two potential N－linked glycosylation sites and two substrate－binding S1pockets.Phylogenetic analyses revealed that the sequences of A.oligosporaisolates from different geographic regions had a high degree of sequence identities and diverged from sequences of the proteases isolated from other nematode－trapping fungi.The present study can lay agood foundation for the preparation of biological agents in the control of gastrointestinal nematodes of domestic.

Arthrobotrys oligospora；serine protease；gene cloning；bioinformatics

S852.659.5

A

1007－7383（2011）06－0700－06

2011－09－13

新疆兵团博士资金项目（2009JC09），石河子大学高层次人才专项（RCZX200901）

王俊伟（1985－），男，硕士研究生，专业方向为分子寄生虫学；e－mail：13649996897＠163.com。

孟庆玲（1969－），女，副教授，博士，从事寄生虫分子生物学研究；e－mail：xjmqlqj＠163.com。