乳制品常见致病菌选择性共增菌技术研究

张巧艳，何腾飞，范萍，平丽英，周育

（1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州 310021；2.浙江工业大学药学院，杭州 310014；3.中美华东制药有限公司发酵工程实验室，杭州 310011）

乳制品常见致病菌选择性共增菌技术研究

张巧艳1，何腾飞2，范萍3，平丽英3，周育1

（1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州 310021；2.浙江工业大学药学院，杭州 310014；3.中美华东制药有限公司发酵工程实验室，杭州 310011）

以乳制品常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为目标菌，研究6种基础培养基、2种培养模式、20种培养基添加剂对增菌的影响，并以无显著抑制效应的添加剂对背景微生物进行了抑菌效应研究，建立了一种选择性富集目标菌的ESS培养基。使用该培养基37℃静止培养16 h，可实现目标菌的共增菌，对可能影响目标菌检测的乳制品中其他致病菌有一定抑制效果。

选择性富集培养基；大肠杆菌；沙门氏菌；金黄色葡萄球菌；抑菌剂

0 引言

大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌常常同时污染乳制品，是引起食物中毒最常见的病原菌。大肠杆菌主要导致腹泻和泌尿道感染。沙门氏菌可导致自愈性胃肠炎，重者可引起致死性伤寒。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌。多重PCR可在同一检测平台上快速检测多种致病菌。当乳制品受污染程度较低时，为防止漏检，需要进行增菌培养；当背景微生物较多时，采用选择性增菌技术，可提高多重PCR检测的准确性。

国内外选择性共增菌培养基主要有：SVV[1]、SSL[2]和SEL[3]等。许一平[4]等报道的BSB培养基具有共增菌效果，但不具有选择性。本研究针对乳制品中常见致病菌，探索一种能够选择性富集大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的共增菌技术，为以后建立多重PCR共检平台提供支撑。

1 实验

1.1 材料

菌种：Y-1为大肠杆菌（Escherichia coli）（CMCC 44102），Y-2为肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）（CMCC 50041），Y-3为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC 21600），Y-5为福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）（CMCC 51571），Y-6为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）（CMCC 63301），Y-17为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（CICC 21633），Y-19为普通变形杆菌（Proteus vulgaris）（CMCC 49027）。Y-1，Y-2，Y-5均购自中国医学细菌保藏管理中心；Y-3，Y-17均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；Y-6为本实验室保藏菌种；Y-19购自上海复祥生物科技有限公司。

化学试剂均为分析纯，牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、葡萄糖等生物试剂均为国产。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备

将供试菌分别接种营养琼脂斜面，37℃培养24 h，转接2次后用无菌生理盐水梯度稀释，接种时控制接种量为10～100 mL-1。

1.2.2 基础培养基的选择

以Y-1，Y-2，Y-3为目标菌，将它们分别各自接入LB，NB，BPW，UPB[5]，TSB，BSB中；37℃以150 r/min振荡培养8，16，24 h；进行平板计数。

1.2.3 培养模式的选择

将目标菌分别各自接入基础培养基中，37℃静止培养和150 r/min摇瓶培养同步进行，分别培养8，16，24 h，测定OD600值和进行平板计数。

1.2.4 添加剂的选择

将目标菌分别各自接入含有不同添加剂的基础培养基中，以接入不含添加剂的基础培养基为阳性对照，37℃培养一定时间，测定OD600值，按下式计算抑制率。

以Y-5，Y-6，Y-17，Y-19为背景微生物，选择对目标菌无显著抑制效应的添加剂，按目标菌的方法进行实验，测定OD600值，计算抑制率，最终确定选择性共增菌培养基的组成。

2 结果与讨论

2.1 基础培养基的选择

将目标菌Y-1、Y-2和Y-3分别接入6种非选择性培养基中进行增菌培养，结果见图1～图3所示。由图1～图3可以看出，培养8 h，BSB基本使3种目标菌同步生长，但增菌量极低，未能达到多重PCR的最低检测限。其它5种培养基对3种目标菌的平行增菌效果差异较大，最大增菌量与最小增菌量的比值均大于100。若共增菌培养仅8 h，可能培养过程处于生长优势的菌会对其它目标菌产生抑制，最终造成漏检。培养16 h，LB和TSB的增菌效果相当，总体上略胜于NB和UPB，但这4种广谱增菌培养基均能使3种目标菌菌量达到108mL-1以上，且从16 h至24 h，菌量几乎没有显著增长。可见，LB，TSB，NB和UPB增菌效果较好，培养16 h就能使3种目标菌均基本进入稳定期。

TSB特别有利于Y-1的生长，培养8 h，使其处于生长高峰，以后进入稳定期和衰退期。过早的增殖不利于3种目标菌的同步生长。UPB曾被用于沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7和单增李斯特氏菌的同步富集培养[5]，显然它对Y-1，Y-2和Y-3的各自增菌效果也较好，但没有显著优势，且成分相对复杂。BPW目前主要用于沙门氏菌、单增李斯特氏菌和阪崎肠杆菌的前增菌培养。用BPW培养目标菌16 h，对杆菌（Y-1和Y-2）的增菌效果显著优于球菌（Y-3）。BSB在整个培养过程中增菌效果均不如其它培养基，可能与氯化钠浓度较高有关，也反映了不同菌对盐的耐受性不同。LB和NB成分均较简单，但培养后期LB增菌效果均略优于NB。这里选择LB为基础培养基。

2.2 培养模式的选择

选择性富集培养基SVV[1]，SSL[2]和SEL[3]共增菌过程均采用摇瓶培养模式。摇瓶培养可保证好氧菌获得充足的溶解氧，从而快速生长。Y-1，Y-2和Y-3均为兼性厌氧菌，在有氧和无氧环境中均能生长。将目标菌各自接入LB中，分别进行静止培养和摇瓶培养，结果如表1所示。由表1可以看出，培养8 h，无论在静止状态下，还是在摇瓶状态下，Y-1生长速度显著优于Y-2和Y-3。培养16 h，摇瓶状态下3种目标菌的菌量均为静止时的10倍左右，且比静止时提早进入稳定期。培养24 h，摇瓶培养和静止培养对Y-3的影响最显著，可能由于该菌为需氧或兼性厌氧菌，在培养后期有氧代谢更易使其获得能量，促进生长。

虽然在整个培养过程中摇瓶培养更有利于3种目标菌的生长，但是培养16 h和24 h，目标菌菌量增加较少，而OD600值却仍显著增加，可能有氧代谢产物干扰了OD600值反映菌量的关系。静止培养16 h，3种目标菌均处于对数生长后期，此时细胞分裂仍较活跃，对添加剂的促进或抑制较敏感，可通过OD600值的变化来反映添加剂的作用。荧光假单胞菌、结核分枝杆菌、炭疽杆菌等乳制品中可能的污染菌为专性好氧菌，在静止条件下基本不能生长。空肠弯曲菌为微需氧菌，肉毒梭菌为专性厌氧菌，它们虽然会污染乳制品，但静止培养仍有一定量的氧气存在，不利于该类菌生长而干扰目标菌的检测。而且摇瓶培养消耗动能，增加成本。所以以后采取静止培养模式，培养时间为16 h。

将3种目标菌同时接入LB中，静止培养16 h，用Baird-Parker琼脂平板和WS琼脂平板分别计数（BP平板上Y-3为黑色菌落，其他两菌不生长；WS平板上Y-1为桔黄色菌落，Y-2为蓝绿色菌落，Y-3不生长。）。Y-1和Y-2菌落数均接近于108mL-1，Y-3仅能达到106mL-1，滞后于Y-1和Y-2至少10倍以上。以后可通过添加促进剂或抑制剂来控制3种目标菌的生长速度。

2.3 添加剂的选择

2.3.1 添加剂对目标菌的作用

将各种添加剂以不同浓度分别加入LB中，研究它们对3种目标菌的促进或抑制效应，结果如表2所示。由表2可以看出，糖、醇类物质提供微生物生长所需的碳源。Y-1可利用乳糖进行发酵，乳糖的存在大大促进其生长，但对Y-2和Y-3的促进效果不显著。阿卡波糖显著抑制Y-3的生长，可能与其抑制α-葡萄糖苷酶活力，影响Y-3对碳源的利用有关。水杨素对3种目标菌无显著抑制作用。甘露醇显著促进3种目标菌的生长。

维生素类物质常作为某些菌的生长因子，参与细胞代谢。烟酰胺是NADH和NADPH的前体，具有抗炎作用。烟酰胺对目标菌作用缓和，只有当质量浓度较高时，才表现出对Y-2和Y-3一定的抑制效应。对氨基苯甲酸是叶酸的前体。当它浓度较低时，对Y-1有较强的促进作用，对Y-2和Y-3作用不明显；随着浓度的增加，抑制效果显著增加；当质量浓度为0.50 g/100 mL时，3种目标菌几乎完全被抑制。可能由于对氨基苯甲酸合成叶酸后引起核蛋白合成受阻，从而达到抑菌的效果。

据报道，许多盐类物质对细菌有选择性抑制作用。由表2可知，亚硫酸钠、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、硫代硫酸钠均强烈抑制Y-3的生长。较低浓度氯化钠对Y-3的生长略有促进作用；当质量浓度较高时，Y-3略受抑制，但能耐高盐维持生长，而Y-1和Y-2受到强烈抑制。金黄色葡萄球菌能通过细胞内积累甜菜碱来适应培养基中的高盐环境[6]。氯化锂和亚碲酸钾常用于抑制非葡萄球菌的微生物。实验结果表明，氯化锂对Y-3略有促进作用，当质量浓度较高时，抑制Y-1的生长。亚碲酸钾对3种目标菌无显著抑制作用。柠檬酸铁铵主要作为乳制品、小麦粉等的营养增补剂，亦用于细菌培养基。表2所示，柠檬酸铁铵对Y-2略有促进作用，当质量浓度较高时，对Y-3有一定抑制作用。硫氰酸钾曾被用作乳制品的非法保鲜剂，它对3种目标菌无显著抑制效果。磷酸氢二钾为细胞代谢提供缓冲，避免细菌产酸导致pH值大幅下降而影响生长。当磷酸氢二钾质量浓度为0.10 g/100 mL时，对3种目标菌无显著影响；当质量浓度为0.50 g/100 mL时，强烈抑制Y-3的生长；当质量浓度为1.00 g/100 mL时，对3种目标菌均有较强的抑制作用。可见，磷酸盐质量浓度过高，也不利于细菌生长，可能与细胞壁结构和电子传递体系有关。

表1 静止培养和摇瓶培养对目标菌增菌的影响

表2 添加剂对目标菌增菌的影响

胆盐类物质通常用于抑制革兰氏阳性菌。实验结果证实，5号胆盐强烈抑制革兰氏阳性的Y-3，对革兰氏阴性的Y-1、Y-2作用不显著。去氧胆酸钠质量浓度较低时，对目标菌的作用不显著；质量浓度较高时（0.20 g/100 mL），抑制Y-3的生长，且抑制作用强于5号胆盐。这两种胆盐对Y-2都略有促进作用。此外，一些抗生素具有抑菌和杀菌活性。磷霉素可抑制细菌细胞壁的早期合成。多粘菌素B可增加细胞的通透性。这两种抗生素强烈抑制3种目标菌的生长（表2）。

抑菌剂抑制效果有浓度依赖性。为了使3种目标菌在共增菌时能够尽量达到较一致的生长速度，选择水杨素、甘露醇、烟酰胺、氯化钠、氯化锂、亚碲酸钾、柠檬酸铁铵、硫氰酸钾、磷酸氢二钾、去氧胆酸钠为目标添加剂，进一步研究它们对背景微生物的作用。

2.3.2 目标添加剂对背景微生物的作用

选择对3种目标菌无显著抑制效应的浓度，将各种目标添加剂分别加入LB中，研究它们对Y-5，Y-6，Y-19的抑制作用，结果见表3。水杨素浓度较高时对Y-6有较显著抑制作用，但对Y-19有一定促进作用。考虑到水杨素对Y-3也有一定抑制作用（表2），共增菌时Y-3本身滞后于Y-1和Y-2，选择水杨素不利于目标菌的同步增菌。甘露醇对Y-5有较显著促进作用，对Y-6有一定抑制作用。由于甘露醇对目标菌均有促进作用（表2），有利于目标菌的复活和快速生长，选择添加质量浓度为1.00 g/100 mL。烟酰胺对Y-5，Y-6和Y-19均无明显抑制作用。质量浓度为2.00 g/100 mL氯化钠和0.20 g/100 mL氯化锂对Y-5和Y-6均有一定抑制作用。由于它们都对Y-3略有促进作用（表2），还可用于调整Y-1和Y-2对Y-3的生长优势抑制。亚碲酸钾对Y-5，Y-6和Y-19的抑制效果与目标菌（表2）相当。柠檬酸铁铵、硫氰酸钾对Y-19略有促进作用，对Y-5和Y-6有一定抑制作用。但由于柠檬酸铁铵在碱性环境中容易发生沉淀；而当硫氰酸钾与其相遇时，它们也会发生反应，影响抑菌效果。低浓度硫氰酸钾更有利于Y-3的增殖（表2）。两者之中选择质量浓度为0.05 g/100 mL硫氰酸钾作为添加剂。质量浓度为0.10 g/100 mL磷酸氢二钾对Y-5和Y-6有一定抑制效果。质量浓度为0.05 g/100mL去氧胆酸钠对Y-6有较显著抑制作用，但它同时对Y-3有一定抑制作用；较低浓度时，对Y-6仍有一定抑制作用，对Y-3略有促进作用。选择其添加浓度为0.01 g/100 mL。所有目标添加剂对Y-19抑制效果均不显著。

将Y-17接入LB中，静止培养16 h，测得的OD600值接近于0，不适宜计算抑制率。用平板计数获得此时菌量为106mL-1，显著低于3种目标菌（表1）。筛选获得的选择性添加剂中硫氰酸钾、去氧胆酸钠对Y-17有一定抑制作用，质量浓度为0.05 g/100 mL硫氰酸钾抑制效果较好，可使Y-17菌量降低100倍。而柠檬酸铁铵对Y-17几乎没有抑制效果。

表3 目标添加剂对背景微生物增菌的影响

3 结论

以乳制品中常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为目标菌，建立了一种选择性共增菌技术。该技术采取37℃静止培养模式，培养时间为16 h，选择性培养基组成为（g/100mL）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，氯化钠2.0，甘露醇1.0，氯化锂0.2，硫氰酸钾0.05，去氧胆酸钠0.01，磷酸氢二钾0.10；pH值为7.0。使用该技术可同时富集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，对乳制品中可能存在的其他微生物有一定的抗干扰能力，为以后提高多重PCR快速检测这3种菌的灵敏度和准确性提供了保障。

[1]覃倚莹,吴晖,肖性龙,等.选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV[J].生物工程学报,2009,25(10):1497-1507.

[2]刘园园,肖性龙,余以刚,等.一种能同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的培养基[J].微生物学报,2009,49(10): 1389-1396.

[3]KIM H,BHUNIA A K.SEL,a Selective Enrichment Broth for Simultaneous Growth of Salmonella enterica,Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,74(15):4853-4866.

[4]许一平,陈福生.一种能同时富集沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养基[J].微生物学通报,2007,34(2):208-211.

[5]NAM H M,MURINDA S E,NGUYEN L T,et al.Evaluation of U-niversal Pre-enrichment Broth for Isolation of Salmonella spp.,Escherichiacoli O157:H7,and Listeria monocytogenes from Dairy Farm Environmental Samples[J].Foodborne Pathogenic Disease,2004,1(1): 37-44.

[6]PEDDIE B A,WONG-SHE J,RANDALL K,et al.Osmoprotective Properties and Accumulation of Betaine Analogues by Staphylococcus aureus[J].FEMS Microbiology Letters,1998,160(1):25-30.

Selective enrichment technology for three main pathogenic bacteria from dairy products

ZHANG Qiao-yan1,HE Teng-fei2,FAN Ping3,PING Li-ying3,ZHOU Yu1
(1.Institute of Quality and Standard for Agricultural Products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;2.College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China;3. Fermentation engineering laboratory,Sino-us east China pharmaceutical Co.,Hangzhou 310011,China)

The enrichment effect of 6 basic media,2 culture methods and 20 medium additives onEscherichia coli,Salmonella enteritidisandStaphylococcus aureusfrom dairy products were evaluated respectively by conventional detection methods.In order to suppress interference detection from other bacteria,10 additives which had no remarkable inhibitory effect on the three target bacteria were selected to study their actions on other pathogenic bacteria such as Shigella flexneri,Bacillus cereusand so on.A new selective enrichment broth(ESS)was formulated to allow a good recovery of the three target pathogens and a more acceptable inhibition of the interference bacteria within 16 h of still incubation at 37℃.

multi-pathogen selective enrichment broth;Escherichia coli;Salmonella enteritidis;Staphylococcus aureus;bacteriostat

TS252.1

A

1001-2230（2011）05-0026-05

2011-02-21

浙江省公益技术研究农业项目（2010C32024）。

张巧艳（1978-），女，助理研究员，从事微生物检测技术研究。

周育