罗非鱼骨粉制备氨基酸螯合钙及其抗氧化性研究

胡振珠，杨贤庆*，马海霞，李来好，吴燕燕，石 红

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201300)

罗非鱼骨粉制备氨基酸螯合钙及其抗氧化性研究

胡振珠1,2，杨贤庆1,*，马海霞1，李来好1，吴燕燕1，石 红1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201300)

利用罗非鱼鱼排、鱼头酶解获得鱼骨粉和复合氨基酸液，然后以罗非鱼骨粉的酸解液为钙源，与复合氨基酸液进行螯合反应制备氨基酸螯合钙，并对其抗氧化性进行研究。在单因素试验的基础上采用多元线性回归正交组合试验，以螯合率为指标，研究复合氨基酸液与罗非鱼骨粉的螯合条件。结果显示：pH7.0、反应时间90min、反应温度60℃、氨基态氮质量浓度1.6g/L，产品螯合率为57.22%。抗氧化研究结果表明，在一定的体积范围内，氨基酸螯合钙浓缩液的还原力随着其体积的增大而增大。氨基酸螯合钙浓缩液对羟自由基的清除率和对超氧阴离子自由基的抑制率分别为6.60%和51.67%。

罗非鱼鱼骨粉；复合氨基酸液；氨基酸螯合钙

科学研究表明钙是人体中极为重要的金属元素[1]，它是骨骼、牙齿的重要组成物质，同时对于血液的凝结，体内一些重要酶的活化，维持神经的传导功能，调节肌肉的伸缩性，保持毛细血管的渗透压，体内的酸碱平衡等方面都起着非常重要的作用。氨基酸螯合钙作为新一代补钙产品，它具有稳定的化学性能，较高的生物效价，无毒、无刺激作用，适口性好[2-4]等优点，是较为理想的人和动物钙补充剂。

近几年来，随着罗非鱼养殖业的不断发展，加工罗非鱼的下脚料(鱼排、鱼头)的数量也在不断地增加，如何综合利用这些废弃物，增加附加值，减少环境污染是今后要解决的难题。本实验以罗非鱼下脚料为原材料，酶解获得鱼骨粉和复合氨基酸液，通过酸解鱼骨粉获得钙源，并与复合氨基酸液反应生成氨基酸螯合钙。以螯合率为指标，研究初始pH值、反应温度、反应时间、氨基态氮浓度等各个条件对螯合反应的影响，从而确定最佳的工艺条件，旨在为罗非鱼排的综合利用提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合氨基酸液(自制)；罗非鱼鱼骨粉(自制)；盐酸、高氯酸、浓硫酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、邻氮二菲、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TD5A-WS离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；PB-10 pH计 赛多利斯科学仪器有限公司；DK-S 24型恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；DHG-9145型电热恒温鼓风干燥箱 上海恒科技术有限公司；EYELA N-100旋转蒸发仪 托普仪器有限公司；GENESYS 5 紫外-可见分光光度计 北京顺达杰欣科隆科技有限公司；Titrando 835 智能电位滴定仪 瑞士万通中国有限公司；AA240FS 原子吸收分光光度计 美国瓦里安技术有限公司；ICS 3000 离子色谱 Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 复合氨基酸液的制备[5]

将罗非鱼下脚料洗净，用保鲜袋分装，放入冰箱(－20℃)中保存。酶解时，将原料取出用自来水解冻，然后加入一定量的水，按原料的质量加入1.5%～2%风味蛋白酶和胰蛋白酶复合酶(比例1:3)，在pH7.0，温度50℃条件下酶解4h，水解完成后在90℃下加热15min灭酶，离心所得的酶解液即为复合氨基酸液。

1.3.2 鱼骨粉的制备[6]

在复合氨基酸液制备中，离心后剩下的沉淀即为骨渣。用清水将骨渣洗净，高温高压蒸煮30min，在75℃烘2.5h，然后放在干燥器中冷却至常温，用粉碎机粉碎得到所需鱼骨粉。

1.3.3 鱼骨中钙含量的测定

溶液中游离钙离子的测定：离子色谱法[7]；溶液中总钙含量的测定：原子吸收法[8]；溶液中螯合钙的测定：溶液中的总钙减去溶液中游离的钙离子[9-10]。

1.3.4 复合氨基酸螯合钙制备

1.3.4.1 工艺流程[11]

1.3.4.2 螯合率的测定

式中：W1为鱼骨粉酸解液中游离钙离子含量/(mg/L)；W2为氨基酸螯合液中总钙含量(mg/L)；W3为氨基酸螯合液中游离钙离子含量/(mg/L)。

1.3.4.3 单因素试验

鱼骨粉酸解液(钙含量一定)中加入不同氨基态氮浓度的复合氨基酸液，在不同温度、不同pH值下反应一定时间后测定螯合率。研究氨基态氮质量浓度、pH值、反应温度及反应时间对螯合率的影响。

1.3.4.4 多元线性回归设计方案[12]

在单因素试验的基础上，以螯合率为指标，对复合氨基酸液浓度、pH值、反应温度及反应时间这4个主要因素进行多元线性回归设计。试验因素及水平表如表1所示。

表1 元线性回归设计因素与水平表Table 1 Factors and levels in the multiple linear regression design

1.3.5 螯合液还原能力的测定[13]

取不同体积的提取液，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液和1g/100mL铁氰化钾各2.50mL并混合均匀，混合液在50℃保温20min后加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸，混合后在3000r/min离心10min，取上清液2.50mL，加入2.50mL蒸馏水及0.50mL 0.1g/mL的FeCl3溶液。测定反应液在700nm波长处的吸光度。吸光度的大小表示还原能力的大小。

1.3.6 氨基酸螯合钙浓缩液对羟自由基清除率的测定[14]

氨基酸螯合钙浓缩液实验方案见表2。

表2 羟自由基清除率的测定条件Table 2 Multiple linear regression design layout and experimental results

1.3.7 氨基酸螯合钙浓缩液对超氧阴离子自由基抑制率的测定[15]

利用O2－·抑制剂能使邻苯三酚自氧化产物在波长320nm处的吸收峰受到抑制这一特点，进行光化学方法间接测定O2－·的抑制率。方法如下：25℃，体系中0.1mL的氨基酸螯合钙浓缩液，再加入2.8mL pH8.2的Tris-HCl缓冲液，振荡混匀，在25℃下水浴保温10min。再加入0.1mL 3mmol/L邻苯三酚溶液(在25℃水浴预热)，迅速混匀并开始计时，320nm处测定吸光度，每隔30s读取A320，5min后结束。以0.1mL去离子水加2.8mL 0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.2)调零。做吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V，按照下式计算样品对超氧阴离子自由基抑制率：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同pH值对螯合反应的影响

图1 pH值对螯合率的影响Fig.1 Effect of pH on calcium chelation rate

由图1可知，在酸性比较强的条件下螯合率很低，在pH6～8范围内时螯合率较高，螯合率为31.26%～36.24%范围之间，在碱性比较强的情况下螯合率也比较低。其原因可能是当反应液中存在大量的H+，H+需要大量的供电基团以形成稳定的物质，与Ca2+争夺供电基团，从而会减少Ca2+的供电基团，减少螯合物的形成[16]。在碱性比较强的情况下，OH－与钙离子形成的氢氧化钙沉淀，其稳定系数大于螯合钙，从而大大减少了螯合钙的形成。

2.1.2 不同螯合温度对螯合反应的影响

由图2可知，温度对螯合率的影响非常显著，在温度比较低的情况下，螯合率比较低，在温度60℃时螯合率最高，为54.74%。而高于60℃时，螯合率开始下降。由此可见，在温度比较低的情况下，反应体系提供的能量不够，不能使反应充分进行，从而导致螯合率的相应减小。在温度较高时，反应体系产生的螯合物在高温下会发生一定程度的分解，减少了螯合物的形成，导致螯合率的下降[17]。

图2 温度对螯合率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on calcium chelation rate

图3 时间对螯合率的影响Fig.3 Effect of reaction time on calcium chelation rate

2.1.3 不同反应时间对螯合反应的影响由图3可知，随着时间的延长，螯合率在不断上升，当反应时间为90min，螯合率达到最大55.62%。之后，随着时间的延长，螯合率开始下降，当反应时间为120min，反应基本上达到平衡。当反应时间延长为150min，螯合率没有太大的变化。在反应时间相对比较短的情况下，螯合反应没有充分完成，因而螯合率相对较小。在反应时间相对较长的情况下，螯合产物会有一定程度的分解，从而导致螯合率的下降。

2.1.4 氨基态氮质量浓度对螯合反应的影响

图4 氨基态氮质量浓度对螯合率的影响Fig.4 Effect of amino nitrogen content on calcium chelation rate

由图4可知，当氨基态氮浓度较低时，螯合率也较低，但随着氨基态氮质量浓度的上升，螯合率在不断上升，当氨基态氮质量浓度为1.6g/L时，螯合率达到最大，为56.62%。当氨基态氮质量浓度大于1.6g/L时，螯合率反而下降，其原因可能是氨基酸与钙的螯合反应存在一个最适比例，大于或小于这个最适比例都会影响螯合率的大小。

2.2 多元线性回归试验结果及分析

表3 多元线性回归试验结果Table 3 Analysis of variance for the developed regression model

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

采用多元线性回归试验设计，结果见表3。应用SPSS软件分析，得到螯合率与因素编码值之间的回归方程：Y=53.09＋1.22X1＋1.38X2－0.29X3＋1.60X4。从表4可以看出，回归模型的F值为4.9，P＜0.05，说明所得的回归方程拟合较好，回归效果显著，因此用此回归方程模型来模拟pH值、温度、时间、氨基态氮质量浓度这4因素与指标值之间的关系是可行的。通过单因素试验和多元线性回归正交组合设计试验的综合对比，优化得到螯合率较高的最佳工艺为多元线性回归正交组合设计中的第9组，即pH7.0、温度60℃、时间90min、氨基态氮质量浓度1.6g/L，此条件下，产品螯合率为57.22%。

2.3 氨基酸螯合钙浓缩液抗氧化能力的研究

2.3.1 氨基酸螯合钙浓缩液还原能力的测定结果

图5 氨基酸螯合钙浓缩液还原能力测定Fig.5 Reducing power evaluation of condensed amino acid chelated calcium solution obtained

由图5可看出，在0.1～0.7mL体积范围内，氨基酸螯合钙浓缩液的还原能力随着体积的增大呈缓慢上升趋势。当体积大于0.7mL时，氨基酸螯合钙浓缩液的还原能力随着体积的增大呈快速上升趋势。这可能是反应存在累积效应，当积累到一定量程度时，反应会突破阈值，速度会加快。

2.3.2 氨基酸螯合钙浓缩液对羟自由基的清除率

图6 氨基酸螯合钙浓缩液对羟自由基清除率结果Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging evaluation of condensed amino acid chelated calcium solution obtained

当加入0.5mg/mL的抗坏血酸0.5mL时，对羟自由基的清除率为6.62%，氨基酸螯合钙浓缩液对羟自由基的清除率6.60%，说明浓缩液的清除自由基的效果已经和0.5mg/mL的抗坏血酸效果相当。

2.3.3 氨基酸螯合钙浓缩液对超氧阴离子自由基的抑制作用

做吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V。测得反应的对照品的速率回归方程为V对照=0.060X＋0.057(R2=0.998)，样品的速率回归方程V样品=0.029X＋0.081(R2=0.999)。所以，当氨基酸螯合钙浓缩液的加入量为0.1mL时，对超氧阴离子自由基的抑制率为51.67%。因此，氨基酸螯合钙浓缩液对超氧阴离子的抑制率效果比较好。

3 结 论

本实验探讨了以罗非鱼鱼排、鱼头作为原料，通过酶解获得鱼骨粉和复合氨基酸液，以罗非鱼骨粉的酸解液为钙源与复合氨基酸液反应制备氨基酸螯合钙工艺条件的研究。最佳制备条件为：pH7.0、反应时间90min、反应温度60℃、氨基态氮质量浓度1.6g/L，产品螯合率为57.22%。同时对氨基酸螯合钙浓缩液的抗氧化性结果表明：在一定的体积范围内，氨基酸螯合钙浓缩液的还原力随着其体积的增大而增大。氨基酸螯合钙对羟自由基的清除率为6.60%，对超氧阴离子自由基的抑制率为51.67%。

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Preparation and Antioxidant Activity Evaluation of Amino Acid Chelated Calcium from Tilapia Scraps

HU Zhen-zhu1,2，YANG Xian-qing1,*，MA Hai-xia1，LI Lai-hao1，WU Yan-yan1，SHI Hong1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201300, China)

Through double-enzyme hydrolysis, tilapia scraps were separated into two fractions, namely a compound amino acid solution and an insoluble residue left after the hydrolysis. The residue was processed into power and further hydrolyzed acidically to offer a calcium-containing solution for the reaction with the above prepared compound amino acid solution,producing amino acid chelated calcium. The optimal chelation reaction conditions for achieving maximum chelation rate were investigated, and the reaction product was tested for its for its antioxidant activity by reducing power and free radical scavenging assays. pH of 7.0, reaction time of 90 min, reaction temperature of 60 ℃ and amino nitrogen content of 1.6 g/L were found optimal, and the resultant chelation rate was 57.22 %. The antioxidant evaluation indicated that the condensed amino acid chelated calcium solution obtained had reducing power in a positive volume-dependent fashion in a proper range. The maximum scavenging rates against hydroxyl and superoxide anion free radicals were 6.60% and 51.67%, respectively.

tilapia bone powder；compound amino acid solution；amino acid chelated calcium

TS254.4

A

1002-6630(2010)20-0141-05

2010-06-30

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAD94B08)；农业部2007年公益性行业(农业)科研专项(3-49)；

国家农业产业技术体系项目(nycytx-48)；国家农业科技成果转化资金项目(2010GB23260577)；

广东省科技计划项目(2009A020700004)；广东省海洋渔业科技推广项目(A200899B02；A200901C01)

胡振珠(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：tiger1986416@163.com

*通信作者：杨贤庆(1963—)，男，研究员，本科，研究方向为水产品加工及质量安全。E-mail：yxqgd@163.com