凡纳滨对虾过敏原酶法消减技术的研究

吴海明，胡志和*

凡纳滨对虾过敏原酶法消减技术的研究

吴海明，胡志和*

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

以凡纳滨对虾为研究对象，用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶对凡纳滨对虾虾肉水解，消减其过敏原。通过间接酶联免疫吸附实验对过敏原消减情况进行检测，以492nm波长处的OD值为指标确定最佳水解条件。结果表明：胰蛋白酶最佳水解条件为：pH8.0、酶与底物质量比1:100、水解温度45℃、底物质量浓度5g/100mL、水解时间3h，水解物OD值为0.085；木瓜蛋白酶最佳水解条件为pH6.5，酶与底物质量比1:100、水解温度为60℃、底物质量浓度5g/100mL、水解时间3h，水解物OD值为0.049。

凡纳滨对虾；过敏原消减；酶联免疫

过敏反应又称为变态反应，是指机体受到抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当机体再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍[1]。在西方发达国家，有2.5%的成年人和6%～8%的儿童会对某些食品过敏[2]。美国有600～700万的过敏患者，每年平均有100～125例因食品过敏而致死的病例[3-4]。中国疾病控制中心营养与食品安全所调查数据显示，在15～24岁年龄段的健康人群中，约有6%的人曾患有食品过敏疾病[5]。近年来有关食用或加工海产品导致过敏的报道层出不穷[6-11]，在联合国粮农组织提出的八大类引起过敏的食物之中，虾与蟹等甲壳类动物及其制品是其中重要的一类[3-5]。蛋白酶能够对过敏原蛋白的结构进行破坏，破坏过敏原的抗原表位，从而降低过敏原的免疫活性。通过筛选出高效专一性的酶对过敏原进行定向酶解，可以有效的降低过敏原[12-14]。本实验以凡滨纳对虾为研究对象，用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶凡纳滨对虾虾肉进行水解，通过间接酶联免疫技术对水解后过敏原消减的程度进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凡纳滨对虾购于天津市老板娘水产城，为活品。海虾过敏人血清(临床症状均为喉咙痒，严重时全身肿)和海虾非过敏人血清都取自天津商业大学校医院，血清均放在－25℃的冰箱中冻存。

胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、HRP标记的羊抗人IgE抗体(A9667) 美国Sigma公司；其他试剂无特殊说明均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；PB-10普及型pH计 Sartorius公司；KDC-160HR型高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；MODUL YOD-230型冷冻干燥机 美国Thermo公司；FA1104N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机 常州国华电器有限公司；RT-6000型酶标分析仪 深圳雷社生命科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 间接酶联免疫检测方法[15]

包被抗原时为减小误差每6孔作为一组，每板有1组做空白，在酶标板中每孔加入100μL待测物后4℃放置过夜后用洗涤液(PBST)洗涤3次，每次5min，在滤纸上拍干后每孔加入封闭液(含质量浓度为1g/100mL BSA的PBST)200μL，37℃水浴2h。封闭结束后，同样用洗涤液洗涤3次，每次5min，拍干后每孔加一抗(含1g/100mL BSA的PBST将海虾过敏人血清稀释20倍) 100μL，37℃水浴2h后洗涤，拍干后加入HRP标记的羊抗人IgE(含1g/100mL BSA的PBST将二抗稀释300倍)37℃水浴2h后洗涤，拍干后每孔加入100μL邻苯二胺底物液室温放置15min，每孔加入50μL终止液(2mol/L H2SO4)后在492nm波长处测定其OD值。

以组织捣碎匀浆后的虾肉作为水解的底物，对水解后的凡纳滨对虾虾肉冻粉进行酶联免疫检测，检测时用未水解的虾肉冻干粉作为阳性对照，用正常人血清为一抗作阴性对照。

1.3.2 胰蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉试验条件的优化

1.3.2.1 胰蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉单因素试验

温度对酶解后过敏原活性影响：采用底物质量浓度10g/100mL、酶与底物质量比1:100、pH8.0的条件水解，改变水解温度(35、40、45、50℃)；底物质量浓度对酶解后过敏原活性影响：采用温度45℃、酶与底物质量比1:100、pH8.0的条件水解，改变底物质量浓度(5、10、15、20g/100mL)；酶与底物质量比对酶解后过敏原活性的影响：采用温度45℃、底物质量浓度10g/100mL、pH8.0的条件水解，改变酶与底物质量比(1:50、1:100、1:200、1:500)。

1.3.2.2 胰蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉正交试验条件的确定

在单因素试验结果基础上，以温度、底物质量浓度和酶与底物质量比为影响因素，以492nm波长处的OD值(每组做6个平行，然后取均值)为考察指标，进行L9(33)正交试验。因素水平见表1。

表1 胰蛋白酶水解凡纳滨对虾正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing trypsin hydrolysis

1.3.3 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉试验条件的优化

1.3.3.1 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉单因素试验

温度对酶解后过敏原活性影响：采用底物质量浓度10g/100mL、酶与底物质量比1:100，pH6.5的条件水解，改变水解温度(50、55、60、65℃)；底物质量浓度对酶解后过敏原活性影响：采用温度60℃、酶与底物质量比1:100、pH6.5的条件水解，改变底物质量浓度(5、10、15、20g/100mL)；酶与底物质量比对酶解后过敏原活性的影响：采用温度60℃、底物质量浓度10g/100mL、pH6.5的条件水解，改变酶与底物质量比(1:50、1:100、1:200、1:500)。

1.3.3.2 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉正交试验条件的确定

根据单因素试验结果，以温度、底物质量浓度和酶与底物质量比为影响因素，以492nm波长处的OD值(每组做6个平行，然后取平均值)为考察指标，进行L9(33)正交试验。因素水平设计见表2。

表2 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing papain hydrolysis

2 结果与分析

2.1 胰蛋白酶水解凡纳滨对虾试验条件的确定

2.1.1 胰蛋白酶水解凡纳滨对虾单因素试验

在用胰蛋白酶水解过程中水解pH值为8.0，水解时间为3h，控制水解温度、底物质量浓度和酶与底物质量比3个参数的变化见表3。

由表3可知，用胰蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉，水解产物的OD值较阳性对照的OD值(0.585)都有所降低。当温度不同时，温度为45℃时，其水解产物OD值(0.176)较低。当底物质量浓度不同时，底物质量浓度为5g/100mL时，其水解产物的OD值(0.085)较低。当酶与底物比不同时，1:100条件下水解产物OD值(0.176)较低。

表3 胰蛋白酶水解虾肉单因素试验结果(x±s)Table 3 Experimental design and results in the single-factor investigation on trypsin hydrolysis (x±s)

2.1.2 正交试验法优化水解条件结果

表4 胰蛋白酶水解虾肉正交试验结果(x±s)Table 4 Experimental design and results in the orthogonal array investigation on trypsin hydrolysis (x±s)

由表4可知，通过胰蛋白酶水解凡纳滨对虾所得产物的酶联免疫检测，得出3种因素对OD492nm值影响大小依次为C＞B＞A，即酶与底物比＞底物质量浓度＞水解温度，较好的实验方案为A2B1C2，即水解温度45℃、底物质量浓度5g/100mL、酶与底物质量比1:100，此条件下其OD492nm值为0.085。

2.2 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾实验条件的确定

2.2.1 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾单因素试验

在用木瓜蛋白酶水解过程中水解pH值为6.5，水解时间为3h，控制水解温度、底物质量浓度和酶与底物质量比3个参数的变化见表5。

表5 木瓜蛋白酶水解虾肉单因素试验结果(x±s)Table 5 Experimental design and results in the single-factor investigation on papain hydrolysis (x±s)

由表5可知，用木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉，水解产物的OD值较阳性对照的OD值(0.585)都有所降低。当温度不同时，温度为60℃时，其水解产物OD值(0.081)较低。当底物质量浓度不同时，底物质量浓度为5g/100mL时，其水解产物的OD值(0.049)较低。当酶与底物比不同时，1:100条件下水解产物OD值(0.081)较低。

2.2.2 木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾正交试验法优化水解条件结果

表6 木瓜蛋白酶水解虾肉正交试验结果(x±s)Table 6 Experimental design and results in the orthogonal array investigation on papain hydrolysis (x±s)

由表6可知，通过木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾所得产物的酶联免疫检测，得出3种因素对OD值影响大小依次为A＞C＞B，即水解温度＞底物质量浓度＞酶与底物质量比，较好的实验方案为A2B1C2，即水解温度为60℃，底物质量浓度为5g/100mL，酶与底物质量比为1:100，此条件其OD值为0.049，该值在正常人血清与抗体反应的OD值的范围内。

3 结 论

采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解凡纳滨对虾虾肉对其过敏原均有消减作用。但采用木瓜蛋白酶水解虾肉，其过敏原的消减效果较好。其在实验范围内的最优条件为：酶与底物质量比1:100、水解温度60℃、底物质量浓度5g/100mL、水解时间3h，经酶联免疫检测其水解物OD值为0.049。该值在正常人血清与抗体反应的OD值的范围内。

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Enzymatic Elimination of Allergens in Litopenaeus vannamei

WU Hai-ming，HU Zhi-he*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

To eliminate the allergens in Litopenaeus vannamei, the meat of this shrimp was hydrolyzed separately with trypsin and papain, and their respective hydrolysis conditions were optimized for achieving minimum optical density at 492 nm (OD492nm) in the indirect ELISA determination of allergen elimination. The optimal conditions for trypsin hydrolysis were determined as follows: pH 8.0; enzyme/substrate mass ratio 1:100; hydrolysis temperature 45 ℃; substrate concentration 5 g/100 mL; and hydrolysis duration 3 h, and the resultant OD492 nm value was 0.085. pH of 6.5, enzyme/substrate mass ratio of 1:100, hydrolysis temperature of 60 ℃, substrate concentration of 5 g/100 mL and hydrolysis duration of 3 h were found optimal for papain hydrolysis, and the minimum OD492 nm value under these conditions was as low as 0.049.

Litopenaeus vannamei；allergen elimination；ELISA

TS207.3

A

1002-6630(2010)19-0038-04

2010-06-27

“十一五”国家科技支撑计划重大项目(2008BAD94B09)

吴海明(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：wuhaiming-22@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn