苦荞麦蛋白质对乳腺癌细胞的增殖抑制作用

郭晓娜，姚惠源

苦荞麦蛋白质对乳腺癌细胞的增殖抑制作用

郭晓娜，姚惠源

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

采用MTT法、HE染色法、扫描电镜法研究苦荞麦蛋白质(TBWSP31)对人乳腺癌Bcap37细胞的增殖抑制作用。结果表明：TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有明显的抑制作用，并且存在时间效应和剂量效应。48h和72h的IC50值分别为43.37、19.75μg/mL。HE染色发现细胞经样品作用后，细胞变形，变小，细胞核固缩、裂解，细胞膜皱褶、卷曲和出泡，并且有细胞膜包裹的凋亡小体生成。扫描电镜下观察细胞表面超微结构，发现细胞出现典型的凋亡形态学特征，细胞表面微绒毛大量减少，有的甚至消失，细胞体积变小，细胞膜皱缩，表面凸起，形成了大量的小泡，有的成为凋亡小体。

苦荞麦；蛋白质；乳腺癌细胞；凋亡

癌症给人类健康所造成巨大威胁，人们一直进行着抗肿瘤活性的天然产物的研究。我国有着丰富的生物资源，从各种生物中筛选安全、高效、低毒的天然抗肿瘤活性成分成为近年来研究的重点课题。

蛋白质、核酸同多糖并称为最重要的三种生物大分子。近年来对蛋白质及肽类的生物活性研究已初步取得了一定进展，研究发现天然蛋白及肽类是一类重要的生物活性物质，具有多方面的生物活性，如增强免疫力、抗肿瘤、降胆固醇、抗氧化等。荞麦蛋白质不仅营养价值高，而且具有独特的生理功能。如降低血液胆固醇[1-2]，阻止7,12-二甲苯蒽诱发的乳腺癌[3]，抑制1,2-二甲阱诱发的大肠癌[4]，抑制胆结石的形成[5]，抗衰老[6]等。前期研究采用体外细胞培养的方法从苦荞麦水溶性蛋白组分中筛选得到了具有抗肿瘤活性的有效组分，本研究主要通过倒置显微镜和扫描电子显微镜对肿瘤细胞形态进行观察，研究苦荞麦蛋白对乳腺癌细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞粉购于四川省凉山州小杂粮粉厂。

RPMI 1640细胞培养基 Gibco公司；小牛血清、胰蛋白酶、Sephadex G-100 上海华美生化试剂公司；谷氨酰胺、MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoloium] Sigma公司；DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200 瑞典 Pharmacia 公司。

1.2 仪器与设备

ZOPR-52D冷冻离心机 日本Hitachi Koki公司；96孔(平底)细胞培养板、24孔细胞培养板 美国Costar公司；CO2培养箱 Thermo公司；倒置相差显微镜 日本Olympus公司；血球计数板 上海医疗器械有限公司；Multiskan MK3酶标仪 Thermolabsystems公司；CPD-030临界点干燥仪、SCD-005离子溅射仪 Bal-Tec公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备

采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换色谱、Sephadex G-100凝胶过滤色谱对苦荞麦水溶性蛋白质逐步分离纯化，并结合细胞实验，筛选出苦荞麦蛋白TBWSP31[7]。

1.3.2 细胞培养[8]

RPMI 1640培养液用1mol/L HCl溶液或NaOH溶液调pH值至7.0～7.2，过滤除菌，用前加入10%小牛血清(FCS)，加入体积分数1%谷氨酰胺溶液(200mmol/L)，加入1mL 100U/mL的青霉素和1mL 100U/mL链霉素，配制成完全培养液。各种肿瘤细胞生长在上述完全培养基中，于37℃、5% CO2，饱和湿度条件下培养，传代至旺盛生长。

1.3.3 TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37细胞增殖抑制率及IC50测定[9]

取对数生长期的Bcap37细胞用0.25g/100mL胰蛋白酶消化，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为5× 104～8×104个/mL，将细胞加入96孔培养板中，每孔100μL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h，再加入用完全培养基将样品稀释成不同浓度的TBWSP31溶液100μL，对照组为加入等体积的RPMI 1640完全培养基，并设生理盐水对照组，每组浓度设8个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24、48、72h。用MTT法计算TBWSP31各个浓度的增殖抑制百分率，以抑制率为纵坐标，TBWSP31浓度为横坐标，根据回归方程计算IC50。

1.3.4 TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37细胞生长的影响

取对数生长期的Bcap37细胞，经0.25g/100mL的胰蛋白酶消化后用含RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为5×104个/mL，然后将细胞接种于24孔培养板中，每孔1mL，将不同浓度的TBWSP31溶液0.1mL加入各培养孔中，每组浓度设3个复孔，对照组直接加等量RPMI 1640完全培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养24、48、72、96h。分别取不同培养时间的细胞，采用苔盼兰染色法进行活细胞计数，每组浓度的细胞数取3个复孔的平均值，并绘制细胞生长曲线。

1.3.5 HE染色观察细胞形态结构

取对数生长期的Bcap37细胞，接种到培养皿中(预先放置盖玻片)，于37℃、5% CO2培养箱中培养24h，细胞在盖玻片上生长贴壁后，加入TBWSP31溶液，对照组不加样品，继续培养48h，小心取出盖玻片，用PBS缓冲液漂洗1～2遍，立即用质量分数4%的多聚甲醛溶液在常温下固定5～10min，即可染色。具体步骤：苏木素染色5min→ 自来水洗 → 盐酸乙醇分化→ 自来水浸泡15min → 伊红染色2min → 常规脱水，然后置于倒置显微镜下拍照[10]。

1.3.6 倒置显微镜和扫描电镜观察细胞形态结构

取对数生长期的Bcap37细胞，接种于细胞培养瓶中，细胞浓度为4×105个/mL，24h后加入TBWSP31溶液，对照组不加样品，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞形态并且拍照，培养48h后，用胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤两次(800r/min，5min)。

细胞立即置于4℃，用体积分数2.5%戊二醛(glutaraldehyde)固定 → 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)漂洗数次 →体积分数1%四氧化锇(osmium tetroxide)固定 → 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)漂洗数次 → 30%、50%、70%乙醇梯度脱水(4℃)→ 室温90%、100%乙醇梯度脱水 → 醋酸异戊酯过渡 → 临界点干燥→ 离子溅射→ 扫描电镜观察、拍照[11]。

2 结果与分析

2.1 TBWSP31对Bcap37细胞增殖抑制率的影响

图1 TBWSP31对Bcap37细胞增殖抑制率的回归曲线Fig.1 Regression curves of inhibition effect of TBWSP31 against the proliferation of Bcap37 cells

通过体外抗肿瘤活性实验可以反映TBWSP31对肿瘤细胞抑制作用的剂量效应和时间效应。TBWSP31对不同培养时间的Bcap37细胞增殖抑制率的影响见图1。随着样品质量浓度的增大，抑制率逐渐增大，当样品质量浓度达到100μg/mL(孔板终浓度)时，曲线趋于平缓，说明当样品达到一定质量浓度时，继续增大样品质量浓度，对增殖抑制率的影响不再明显。通过回归方程，可以得到不同作用时间下的IC50值。作用24h时，IC50值高达528.4μg/mL，而作用48h和72h的IC50值分别为43.37、19.75μg/mL，这说明作用时间对Bcap37细胞的增殖抑制作用的影响非常显著(P＜0.05)。

2.2 TBWSP31对Bcap37细胞生长的影响

图2 TBWSP31对Bcap37细胞生长的影响Fig.2 Effect of TBWSP31 treatment on the growth curve of Bcap37 cells

生长曲线能体现肿瘤细胞在体外培养过程中增殖动态的变化，反应抑制作用的剂量效应和时间效应。将Bcap37细胞培养不同时间后计数，绘制细胞生长曲线，结果见图2。对照组(未加样品)在培养24h内，细胞由于刚贴壁，生长缓慢，培养24h后，细胞开始增殖旺盛，细胞数量成倍增长。加样量为50μg/mL时，72h内细胞数量逐渐增大，与对照组相比，细胞增殖受到抑制，72h后，细胞数量迅速减少(P＜0.05)。加样量为100μg/mL(孔板终浓度)时，72h内细胞也在缓慢生长，但是增殖幅度很小，72h后，细胞数量逐渐减少(P＜0.05)。加样量为200μg/mL时，细胞基本上不再生长，增殖明显受到样品的抑制(P＜0.01)。

2.3 HE染色观察细胞形态结构

图3 HE染色观察Bcap37细胞形态的变化(10×40)Fig. 3 Morphological change of Bcap37 cells due to treatment with 10 μg/mL TBWSP31 observed under an invert microscope after HE staining (10×40)

培养于盖玻片上的Bcap37细胞，经过爬片生长，HE染色后倒置显微镜拍照，如图3所示。对照组细胞生长致密，细胞核完整，染成均一蓝色，细胞质为粉红色。细胞经样品作用后，呈现细胞凋亡的明显特征，细胞变形，变小，细胞核固缩、裂解，染色质染成深蓝色或蓝黑色，细胞膜皱褶、卷曲和出泡，并且有细胞膜包裹的凋亡小体生成。

2.4 TBWSP31对细胞形态的影响

2.4.1 倒置显微镜观察细胞形态

不同质量浓度的TBWSP31对Bcap37细胞作用48h后，将培养瓶置于倒置显微镜下拍照，观察细胞形态变化，如图4所示。对照组细胞呈多边形，大小均匀，细胞表面折光性强，细胞贴壁良好，生长旺盛，细胞排列紧密，与周围细胞连接黏附。加样组细胞生长受到抑制，细胞变形、皱缩、变小、贴壁性不佳，折光性变差，细胞排列疏松，与周围细胞连接黏附消失。样品作用质量浓度为5μg/mL与10μg/mL时，细胞形态上未见太大区别，10μg/mL时圆形细胞增多，而且体积变小的悬浮细胞增多。

图4 不同质量浓度TBWSP31对Bcap37细胞作用48h时的细胞形态(10×20)Fig.4 Morphologic change of Bcap37 cells due to treatment with different concentrations of TBWSP31 for 48 h observed under an invert microscope (10×20)

2.4.2 扫描电镜观察细胞形态

图5 扫描电镜观察Bcap37细胞形态的变化Fig.5 Morphologic change of Bcap37 cells due to treatment with 20 μg/mL TBWSP31 observed under a SEM

TBWSP31对Bcap37细胞作用48h后，胰蛋白酶消化收集细胞，固定后在扫描电镜下观察细胞表面超微结构的变化，如图5所示。对照组细胞表面有大量的微绒毛存在(图5A1、5A2)，细胞比较圆整。TBWSP31对Bcap37细胞作用后，细胞出现典型的凋亡形态学特征，细胞表面微绒毛大量减少，有的甚至消失，细胞体积变小，细胞膜皱缩，表面凸起，似出芽现象，形成了大量的小泡，有的小泡已经脱落，成为凋亡小体(apoptotic bodies)(图5B1、5B2)。

3 结 论

本研究主要采用倒置显微镜和扫描电子显微镜对肿瘤细胞形态进行观察，研究苦荞麦蛋白质TBWSP31对Bcap37细胞的作用方式及作用机理：体外抗肿瘤活性实验(MTT法)表明，TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有明显的抑制作用，并且存在时间效应和剂量效应。48h和72h的IC50值分别为43.37、19.75μg/mL。HE染色发现细胞经样品作用后，细胞变形、变小、细胞核固缩、裂解，染色质染成深蓝色或蓝黑色，细胞膜皱褶、卷曲和出泡，并且有细胞膜包裹的凋亡小体生成。扫描电镜下观察细胞表面超微结构，发现细胞出现典型的凋亡形态学特征，细胞表面微绒毛大量减少，有的甚至消失，细胞体积变小，细胞膜皱缩，表面凸起，似出芽现象，形成了大量的小泡，有的小泡已经脱落，成为凋亡小体。

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Anti-proliferative Effect of Tartary Buckwheat Protein Fraction TBWSP31 on Breast Cancer Cells

GUO Xiao-na，YAO Hui-yuan
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

The inhibition effect of a protein fraction TBWSP31 prepared from tartary buckwheat as described in our previous study on the proliferation of Bcap37 cells was investigated by MTT assay, HE staining and scanning electron microscopic (SEM) observation. TBWSP31 exhibited a notable anti-tumor activity in dose- and time-dependent manners and was also sensitive to human mammary cancer cell Bcap37 with IC50values of 43.37 (48 h)μg/mL and 19.75μg/mL (72 h), respectively. After treated with TBWSP31 for 48 h, Bcap37 cells revealed typical apoptotic characteristics. The HE-stained cells exhibited visible morphological changes such as nuclear fragmentation, chromatin condensation, plasma-membrane blebbing and production of apoptotic bodies under a light microscope. The SEM observations revealed that the decrease of villus, even partial disappearance, plasma-membrane blebbing and production of apoptotic bodies.

tartary buckwheat；protein；breast cancer cells；apoptotic

TS210.1

A

1002-6630(2010)19-0317-04

2010-01-19

国家自然科学基金项目(30900999)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(200802951003)

郭晓娜(1978—)，女，副教授，博士，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：gxn1978@hotmail.com