Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡信号通路的增龄性变化及爬梯运动对其的影响

李海鹏,王立丰,关尚一,马景亮,丁树哲,卢 健

Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡信号通路的增龄性变化及爬梯运动对其的影响

李海鹏1,王立丰2,关尚一2,马景亮2,丁树哲2,卢 健2

目的:探讨Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡信号通路中各凋亡基因的增龄变化情况及爬梯运动对其的影响。方法:以快速老化(Senescence-accelerated mice p rone/8, SAMP8)小鼠为衰老动物模型,将其分为青年安静组(YC组)、老年安静组(OC组)和老年爬梯运动组(OR组),采用实时荧光定量PCR的方法,分别对各组腓肠肌Caspase依赖性凋亡通路中相关基因(Cyt C、apaf-1、Caspase-9和Caspase-3)和Caspase非依赖性凋亡通路中相关基因(PARP、A IF和Endo G)进行检测。结果:OC组腓肠肌Sarcopenia Index(SI)值显著低于YC组;随增龄OC组腓肠肌中apaf-1、Caspase-3和PARP的表达均显著上调,而A IF却显著下调;爬梯运动能够下调OR组腓肠肌中Cyt C和Caspase-3的表达,而A IF和Endo G却未见显著性变化。结论:老年SAMP8小鼠腓肠肌可作为Sarcopenia研究模型;Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡信号通路中Caspase依赖与Caspase非依赖两条凋亡途径发挥的作用存在一定差异,衰老骨骼肌质量衰减与否以及衰减程度最终有赖于两条途径之间的对抗; 8周爬梯运动能够一定程度上弱化老年小鼠腓肠肌中的凋亡信号,避免其更大范围地进入凋亡程序而加剧Sarcopenia,对“脆弱”的骨骼肌起到一定的保护作用。

肌肉衰减征;爬梯运动;线粒体;细胞凋亡;鼠;动物实验

肌肉衰减征(Sarcopenia)作为一种以骨骼肌质量衰减为主要特征的增龄性机能退化征,长期以来为人们所忽视。然而,近年来,Sarcopenia所带来的老年人健康维护成本的骤增却日益凸显,逐渐引起研究者的广泛关注[1,13,18]。目前,国内、外有关Sarcopenia机制的研究方兴未艾,尤其线粒体介导的细胞凋亡信号通路在Sarcopenia的发生发展过程中的作用更值得关注,而线粒体作为细胞凋亡的调控中心,可通过Caspase依赖性凋亡通路与Caspase非依赖性凋亡通路分别介导细胞凋亡[3]。众所周知,衰老模型动物的选择对Sarcopenia发生机制的研究至关重要。有研究表明,快速老化(Senescence-accelerated mice p rone/8,SAMP8)小鼠是一类正常发育和成熟后显示衰老加速效应的近交系小鼠,一般寿命约为358天(约51周龄),其在生长期与普通纯种小鼠无异,但在渡过生长期(即16～24周龄)后则迅速出现老化诸特征。鉴于此,Derave等人已将SAMP8小鼠引入Sarcopenia研究[8]。另据报道,运动(尤其抗阻运动)能够在一定程度上对Sarcopenia的发生发展起到延缓与治疗的作用[15]。因此,本文拟对SAMP8衰老小鼠及爬梯运动干预后骨骼肌中线粒体介导的细胞凋亡信号通路中凋亡基因变化情况进行检测,以期有助于进一步了解Sarcopenia发生的机制及运动干预效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性快速老化(SAMP8)小鼠30只,购自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心(实验动物饲养许可证编号:W-J津实动质M准字第006号)。购入后于本实验中心动物房IVC独立送风饲养系统中在SPF条件下分笼饲养,以国家标准啮齿类饲料[购自上海斯莱克实验动物公司,许可证号:SCXK(沪)2007-0005]喂养,自由饮食、饮水。自然光照并遵循明暗周期,温度范围20℃±2℃,相对湿度55%±5%(表1)。

表1 本研究实验动物分组及饲养/训练情况一览表Table 1 Program of Grouping,Feeding and Training of Animals

1.2 运动方案

以小鼠尾部负重爬梯方式进行爬梯抗阻运动(爬梯由研究者设计自制),在适应性饲养1周后开始训练,训练时间选择在动物的暗周期(18:00～20:00)进行,起始负重量为50%BW,随后逐渐递增并参照文献[11]摸索适宜的负重重量、爬梯的重复次数及每组训练的时间间隔,分别为3 Sets/day,3～4 Reps/Set,间隔20 s/Rep;间隔2 min/Set,训练隔天进行,以此建立抗阻爬梯运动模型(表2)。

表2 本研究实验动物爬梯运动方案一览表Table 2 Proposal of Ladder Climbing Exercise

1.3 取材

末次爬梯运动后24～48 h,将小鼠断头处死,迅速取完整后肢腓肠肌(Gastrocnemius,G),称量肌肉重量,锡箔纸包裹并标记后迅速置于液氮中,后转移至-80℃超低温冰箱保存备测。

1.4 SI值的求得

选用Edstrom提出的SI值作为间接判断Sarcopenia的标准。SI值的获得由靶骨骼肌的质量/受试体重求得[10]。

1.5 RNA的提取及鉴定

取腓肠肌样品100 mg左右,参照Trizol试剂盒说明书抽提RNA。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法(OD260/OD280)对RNA的完整性和纯度进行检测,确认28 s、18 s、5 s 3条带以及OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间。

1.6 RNA逆转录

取RNA 2μL以Oligo(d T)15(50 pmol/μL)合成cDNA。M-MLV试剂盒购自Promega公司。

1.7 实时荧光定量PCR

查找目的基因全序列,采用Primer Exp ress 3.0设计软件设计引物,并由上海捷瑞公司合成,相关信息见表3。Realtime PCR反应体系为20μL,其中SYBR Premix(TOYOBO)10μL,前向、反向引物(10μM)各1μL,模板4μL,无RNase水补足。反应条件Stage 1:(1×)95℃,3 min; Stage 2:(45×)Step 1:95℃,20 s,Step 2:Tm,20 s,Step 3:72℃,20 s(收集荧光);Stage 3:(1×)95℃,1min;Tm, 20s;缓慢升温(收集荧光)至95℃,10s。经仪器自动分析,各基因融解曲线(Melt Curve)均为单峰,表明扩增产物特异性较高。以管家基因β-actin为内参基因,各目的基因相对量Relative Exp ression(RE)由2-ΔΔCt计算求得。

表3 本研究各基因引物序列及相关信息一览表Table 3 Sequencesand Details of Target Genes

1.8 数据处理

由SPSS for Window s 15.0统计软件包进行数据处理,运用单因素方差分析(One Way ANOVA)对数据进行分析。数据以Mean±SD表示,差异显著性水平定义为P< 0.05。

2 实验结果

2.1 SI值的计算结果

经过计算求得的青年组与老年组SAMP8小鼠腓肠肌SI值见图1。由图1可知,OC组SI值较YC组SI值有所下降,且差异具有显著性(P<0.05),满足Baumgartner等人提出的Sarcopenia的基本判定标准之一[6],提示,老年组SAMP8小鼠腓肠肌已表现出Sarcopenia。

图1 YC组与OC组腓肠肌SI值示意图Figure 1. Values of SI in YC&OC Group

2.2 骨骼肌中Caspase依赖性凋亡通路中凋亡基因的表达

图2 各组Cyt C的表达情况示意图Figure 2. Expression of Cyt C in Each

图3 各组apaf-1的表达情况示意图Figure 3. Expression of Apaf-1 in Each Group

图4 各组Caspase-9的表达情况示意图Figure 4. Expression of Caspase-9 in Each

2.3 骨骼肌中Caspase非依赖性凋亡通路中凋亡基因的表达

图6 各组PARP的表达情况示意图Figure 6. Expression of PARP in Each

图7 各组AIF的表达情况示意图Figure 7. Expression of A IF in Each

图8 各组Endo G的表达情况示意图Figure 8. Expression of Endo G in Each

3 分析与讨论

3.1 Sarcopenia的判定

目前,虽然国内、外广大研究者未能就Sarcopenia的临床医学鉴定做出统一标准,但是已经研究并制订了不少切实有效的指标来对Sarcopenia加以定性。Baumgartner是国际上较早对Sarcopenia提出判定参数的学者之一,其研究认为,Sarcopenia的发生与否可以通过相对骨骼肌质量指数(Relative Skeletal Muscle Index,RSM I)进行鉴定,并提出对于老年人而言,当其RSM I值低于其青年对照组RSM I值2×SD以上或者男性RSM I值<7.62 kg/m2、女性RSM I值<5.45 kg/m2时,即可判定为Sarcopenia[6]。此外,骨骼肌质量参数、肌肉力量以及握力等也可作为判定Sarcopenia的间接评价参数。然而,虽然RSM I是较为准确的评价参数,但是,由于计算过程中所需的四肢骨骼肌的质量值必须经由DEXA、MRI以及CT等手段来测定,这样势必造成Sarcopenia判定时的高成本以及低普遍性。鉴于本实验中的研究对象为小鼠,对其使用以上各种检测手段进行ASM检测的可行性较低,因而,选取SI值间接判定Sarcopenia。由图1可以看出,OC组小鼠较YC组小鼠腓肠肌中SI值呈显著性降低,且降低幅度达2×SD以上,符合Edstrom提出的Sarcopenia的间接判定标准,因而,可以认为本研究中老年组SAMP8小鼠腓肠肌已表现出Sarcopenia征状,这一点与Derave研究中对比目鱼肌的研究较为一致[5]。

3.2 衰老过程中Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡通路的变化

已有的研究表明,在啮齿类动物以及人类衰老过程中细胞凋亡对Sarcopenia的发生发展起着重要的调节作用。据报道[2],线粒体介导的Caspase依赖性细胞凋亡信号通路中,Cyt C与apaf-1和p rocaspase-9结合可形成被称为凋亡小体的复合物(图9)。在ATP及其水解酶存在时,Cyt C～apaf-1复合物寡聚化,促使p rocaspase-9自身活化成Caspase-9进而激活Caspase-3。本研究观察到,随年龄增加,SAMP8小鼠腓肠肌中apaf-1和Caspase-3的表达均显著上调,与Song等人的研究结果较为一致[21]。Siu等通过对青年组和老年组F344×BN大鼠后肢腓肠肌中凋亡信号基因的研究也发现,衰老促进了凋亡信号(Cyt C、apaf-1、Caspase-3和Caspase-9)在骨骼肌中的表达[20]。Pistilli等人的研究也显示,衰老过程中大鼠跖肌中apaf-1 mRNA水平有所上升[17]。然而,Baker等人的研究却发现,随增龄F344×BN大鼠跖肌中apaf-1的表达显著下调,只是Caspase-3和Caspase-9的表达显著上升,经相关分析后确认,Caspase-3和Caspase-9的表达与Sarcopenia的发生进程具有高度相关性[5]。由以上研究可以看出,衰老过程中Sarcopenia的发生发展与Caspase依赖性细胞凋亡通路中凋亡信号变化密切相关。

图9 细胞凋亡信号调控通路示意图Figure 9. Signaling Pathway of Apoptosis

然而,Sarcopenia相关的线粒体介导的细胞凋亡信号通路并不完全都是Caspase依赖性的,在另外一些情况下,对Caspase的抑制并不能完全阻止细胞凋亡的发生,这就意味着除此以外还有其他凋亡信号通路存在,而且是Caspase非依赖性的[4]。近来研究发现,凋亡诱导因子(A IF)和核酸内切酶G(Endo G)可能发挥着一定的Caspase非依赖性致凋亡作用(图9)。目前已知,A IF是存在于线粒体膜间隙中的一种黄素蛋白,在凋亡信号刺激时,过度激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)可引起A IF从线粒体的释放,然后转位到细胞核内,与线粒体蛋白质Endo G一起引起细胞染色体的凝聚和DNA大范围的片段化,从而使细胞发生凋亡。本研究观察到,随年龄增加,OC组SAMP8小鼠腓肠肌中PARP有所上调,A IF明显下调,而Endo G未见显著性变化。提示,在Sarcopenia老年小鼠腓肠肌中Caspase非依赖性细胞凋亡信号通路有所下调,从而避免了衰老骨骼肌中经由Caspase非依赖性细胞凋亡途径而进一步凋亡的趋势。Leeuwenburgh等的研究[12]显示,老年组与青年组F344×BN大鼠比目鱼肌中Endo G水平未见显著性差异,与本研究结果较一致。然而,Chung等的研究结果却显示,与16月龄组相比,29月龄组F344× BN大鼠腓肠肌中A IF未见显著性差异[7]。Baker等研究发现,跖肌中A IF表达随增龄显著性上调,并认为A IF的增龄性显著上调参与并在一定程度上促进了骨骼肌的细胞凋亡,进而导致Sarcopenia[5]。Marzetti等研究结果显示,随增龄F344×BN大鼠骨骼肌中DNA片段化水平上调,且老年以及高龄老年大鼠腓肠肌中A IF与Endo G均有所上调,而胞浆中Cyt C以及Bax/Bcl-2比值均未随增龄发生显著性改变。因而得出结论,线粒体介导的Caspase非依赖性细胞凋亡信号通路可能较之于Caspase依赖性细胞凋亡信号通路发挥着更为主导的作用[14]。Dupont-Versteegden等研究也认为,Caspase-3在废用性肌萎缩中发挥重要作用,而在增龄性骨骼肌衰减中似乎非Caspase依赖的途径占有主导作用[9]。不难看出,以上这些研究与本研究结果存在较大的差异。然而,毕竟衰老与Caspase非依赖性细胞凋亡的关系也很复杂,不同类型骨骼肌细胞在衰老进程中对线粒体介导的Caspase非依赖性细胞凋亡的敏感性表现各异(促进或抑制),但细胞凋亡参与了整个衰老过程,并在其中各个环节发挥了重要作用,这一点是毋庸置疑的。

3.3 爬梯运动对Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡通路的影响

长期以来,人们把关注的重点一直放在有氧运动对细胞凋亡的影响方面,而未涉及抗阻运动,甚至错误地认为抗阻运动对老年人来说是件危险的运动。事实上,如果给予适当的负荷,抗阻运动将是非常安全的运动干预方式。本研究尝试引入小鼠爬梯运动模型用于Sarcopenia研究中,通过受试克服自身体重来完成运动干预任务,避免或减少了电刺激等外在强刺激所带来的无法预测的影响,不失为一种受试自发进行抗阻运动的选择。

本研究对爬梯运动干预后老年组Sarcopenia小鼠骨骼肌中线粒体介导的细胞凋亡通路影响的结果显示,为期8周的爬梯运动显著下调了OR组SAMP8小鼠腓肠肌中Cyt C、Caspase-3以及PARP的表达,只是A IF和Endo G却均未发生变化。提示,尽管OR组SAMP8小鼠腓肠肌中A IF和Endo G对爬梯运动干预不敏感,但爬梯运动仍能够通过下调凋亡效应子——Caspase-3的表达而在一定程度上弱化衰老骨骼肌凋亡的潜能。遗憾的是,鉴于目前抗阻运动对老年人骨骼肌的影响多侧重于宏观研究,因而,关于抗阻运动对衰老骨骼肌细胞凋亡信号通路影响的动物实验研究还非常有限。目前,仅有Siu等人以日本鹌鹑进行了部分研究,其通过对青年组和老年组日本鹌鹑翅膀快肌纤维百分比较高的翼状肌(patagialis muscles,PAT)进行负重研究后发现,老年组在负重21天后Cyt C显著下调,且A IF表达下调了29%(P<0.05),并由此认为鹌鹑翅膀负重在一定程度上起到了抗凋亡效应。不可否认,鹌鹑与小鼠虽均已作为模型动物,但是从物种的基因聚类以及基因亲缘关系来看,对啮齿类动物的研究将更具有说服力。尽管如此,该研究还是一定程度上支持了本研究[19]。今后,随着大鼠、猿等实验动物的引入以及相关研究的逐渐深入,研究者们必将能够为“抗阻运动能够延缓或逆转Sarcopenia”的观点[16]提供更多、更有力的佐证。

4 结论

1.老年SAMP8小鼠腓肠肌可作为Sarcopenia研究模型。

2.Sarcopenia关联的线粒体介导的细胞凋亡信号通路中Caspase依赖与Caspase非依赖两条凋亡途径发挥的作用存在一定差异,衰老骨骼肌质量衰减与否以及衰减程度最终有赖于两条途径(促凋亡或抑凋亡潜能)之间的对抗。

3.8周爬梯运动能够在一定程度上弱化老年小鼠腓肠肌中的凋亡信号,避免其更大范围地进入凋亡程序而加剧Sarcopenia,对“脆弱”的骨骼肌起到一定的保护作用。

总而言之,爬梯运动作为一种较新的运动模型,在衰老小鼠骨骼肌研究中的应用刚刚起步。相信随着运动、衰老与细胞凋亡之间相互关系的进一步阐明,对Sarcopenia发生机制的了解将逐渐深入,最终为抗阻运动干预促进老年人骨骼肌健康提供帮助。

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Age Related Change of M itochondria Mediated Apoptotic Signaling Pathway in Sarcopen ia M ice and Influence of Ladder Climbing Exercise

L I Hai-peng1,WANG Li-feng2,GUAN Shang-yi2, MA Jing-liang2,D ING Shu-zhe2,LU Jian2

Objective:To discuss the change of apop totic genes in Sarcopenia related mitochondria mediated apop to tic signaling pathway,and the effects of ladder climbing exercise on it.Methods:SAM P8 mice are selected as the aging model animal,w ith the grouping of young control group(YC),old control group(OC)and old resistant exercise group(OR).The method of real-time PCR is used to detect the changes of apop totic genes,such as Cyt C,apaf-1,Caspase-9,Caspase-3,PARP,A IF and Endo G in each group.Results:(1)Value of SIin gastrocnemius of OC group is lower than that of YC group significantly;(2)Exp ression of apaf-1, Caspase-3 and PARP increase significantly with aging,on the contrary the exp ression of A IF decreases significantly;(3)Ladder climbing exercise dow n-regulates the exp ression of Cyt C and Caspase-3,but has no effect on A IF and Endo G.Conclusion:(1)The gastrocnemius of senile SAM P8 mice can be used as a model for the research of Sarcopenia;(2)Sarcopenia related mitochondrial mediated Caspase dependent and independent apop totic signaling pathways show different directions during apop to tic selection,therefo re,the final result,Sarcopenia o r not,depends on the antagonism between the two pathways;(3)Eight weeks ladder climbing can attenuate the inclination of the apop tosis in the frail senile mice to avoid further advancing fo r apop tosis and Sarcopenia finally.

Sarcopenia;ladder climbing;m itochondria;apoptosis;rat;animal experiment

G804.5

A

1000-677X(2010)07-0056-06

2010-02-26;

2010-06-25

李海鹏(1982-),男,山西临汾人,讲师,博士,研究方向为运动与骨骼肌衰老(Sarcopenia),E-mail:ecnudocto r@ 126.com;王立丰(1982-),男,回族,辽宁辽阳人,在读博士研究生,研究方向为运动与骨骼肌衰老,E-mail:wanglifeng1982@126.com;关尚一(1981-),男,广东台山人,在读博士研究生,研究方向为运动适应及其调控,E-mail:gsyone@126.com。

1.台州学院体育科学学院,浙江临海317000;2.华东师范大学体育与健康学院,上海200241 1.Department of Physical Education,Taizhou University,Linhai 317000,China;2.College of Physical Education and Health,East China Normal University,Shanghai 200241,China.