人脑干和幕上胶质瘤N-cadherin和β-catenin mRNA的表达

马俊艳,武文浩,田永吉,历俊华,张力伟,万虹,郝淑煜,李德志,阴鲁鑫

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,其中脑干胶质瘤是恶性程度较高的肿瘤,比其他部位胶质瘤侵袭性强、预后差。临床研究发现,脑干胶质瘤绝大多数呈弥漫性生长,而幕上胶质瘤往往呈局限性生长,并且幕上胶质瘤患者的预后明显好于脑干胶质瘤,但其中的具体机制目前仍不清楚。近年来,N-cadherin和相关因子β-catenin在胶质瘤侵袭性的发生及发展中的重要作用已成为研究的热点[1-3]。本文拟采用RT-PCR方法分别检测N-cadherin和β-catenin mRNA在脑干和幕上胶质瘤中的表达,探讨N-cadherin和β-catenin及其复合体在脑干和幕上胶质瘤发病中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 材料 收集首都医科大学附属天坛医院神经外科颅底脑干病区2008年1月～2009年11月手术切除的18例脑干胶质瘤和18例幕上胶质瘤标本,均经病理科诊断确诊。标本离体后均立即保存于液氮罐中。病例中男性23例,女性13例,平均年龄37岁。根据1999年WHO确定的病理分级标准将其划分为4级:Ⅰ级1例、Ⅱ级19例、Ⅲ级 3例、Ⅳ级13例。其中低级别(Ⅰ～Ⅱ级)脑干和幕上胶质瘤各10例,高级别(Ⅲ～Ⅳ级)脑干和幕上胶质瘤各8例。

总RNA提取液TRIzol:北京金驰同信科技发展有限公司;引物:Invitrogen Biotechnology Co.,Ltd;PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒及DNA Marker:TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

取样本100 mg,研磨后用 TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,DNA核酸分析仪测OD260/OD280比值(1.9～2.1),计算核酸浓度。RTPCR反应按TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒说明书操作:5 μ g 模板 RNA 、20 μ l RT 体系 、50 μ l PCR体系。

引物序列 :N-cadherin:上游:5′-GTG CCA T TA GCC AAG GGA AT T CAG C-3′;下游 :5′-GCG TTC CTG TTC CAC TCA TAG GAG G-3′;β-catenin:上游 :5′-ACC TCC CAA GTC CTG TAT GAG TG-3';下游 :5′-CAT CTG AGG AGA ACG CAT GAT-3′;GAPDH(内参):上游 :5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′;下游:5′-TTG AT T TTG GAG GGA TCT CG-3′。

PCR反应条件:预变性94℃、5 min,变性94℃、30 s,退火53 ℃、45 s,延伸 72 ℃、45 s,共进行30个循环,最后延伸72 ℃、10 min。

1.2.2 RT-PCR反应产物相对定量分析 每一样本以管家基因GAPDH作为内参照。RT-PCR结果用2%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结果用Gel-Pro凝胶分析系统行扫描及灰度分析,对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分,每一样本计算N-cadherin和βcatenin与GAPDH条带吸光度积分的比值,此值为各样本mRNA的相对量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件对 N-cadherin和β-catenin在不同病理级别、不同部位胶质瘤之间的比较进行独立样本t检验。对N-cadherin和β-catenin在脑干和幕上胶质瘤中的相互关系采用相关分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 N-cadherin 在高级别脑干胶质瘤中,5例标本呈强阳性表达,3例呈中等强度表达;在低级别脑干胶质瘤中,7例呈中等强度表达,3例呈弱阳性表达。在高级别幕上胶质瘤中,2例标本呈强阳性表达,3例呈中等强度表达,3例呈弱阳性表达;在低级别幕上胶质瘤中,2例呈强阳性表达,3例呈中等强度表达,5例呈弱阳性表达(图1)。N-cadherin mRNA在脑干和幕上胶质瘤中的表达无显著性差异(P＞0.05);在幕上胶质瘤高低级别间的表达无显著差异(P＞0.05);在脑干胶质瘤高低级别间有显著性差异(t=2.711,P＜0.05)。见表1。

2.2 β-catenin 在高级别脑干胶质瘤中,5例标本呈强阳性表达,3例呈中等强度表达;在低级别脑干胶质瘤中,2例标本呈强阳性表达,6例呈中等强度表达,1例呈弱阳性表达。在高级别幕上胶质瘤中,5例标本中等强度表达,3例呈弱阳性表达;在低级别脑干胶质瘤中,2例标本呈强阳性表达,3例呈中等强度表达,5例呈弱阳性表达(图2)。β-catenin mRNA在脑干胶质瘤中的表达高于幕上胶质瘤(t=2.255,P＜0.05)。βcatenin mRNA在脑干和幕上各级别胶质瘤中的表达无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 N-cadherin和β-catenin与GAPDH电泳条带的面积积分比值

图1 N-cadherin RT-PCR电泳结果

图2 β-catenin RT-PCR电泳结果

2.3 相关性分析 N-cadherin和β-catenin mRNA在脑干(r=0.480)和幕上(r=0.809)胶质瘤中的表达均呈正相关(均P＜0.05)。

3 讨论

脑干是人体生命中枢,由于脑干解剖结构和功能的特殊性,目前对脑干胶质瘤的研究只限于临床观察。本研究首次从转录水平研究比较了脑干和幕上胶质瘤中N-cadherin和β-catenin的表达,对脑干胶质瘤的生物学特性作了初步探讨。

N-cadherin分子量约为130 kDa,主要分布于神经和肌肉组织,是一类介导细胞间同质黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白,在神经轴突的导向生长、靶向识别以及突触形成中起重要作用,多种信号转导成分参与上述过程的调控。目前对于胶质瘤中N-cadherin的研究,国外文献报道并不一致。Asano等研究发现,N-cadherin表达的减少与胶质瘤侵袭行为增强和肿瘤复发有关,并认为 N-cadherin表达与周边浸润呈负相关[4]。而Utsuki等发现,N-cadherin表达的增加与胶质瘤侵袭行为增强有关[5]。体外实验表明,给N-cadherin表达阴性的癌细胞转染N-cadherin后,细胞的侵袭性明显增强[6]。国内文献报道均认为,N-cadherin的表达随着胶质瘤级别的升高而增高[7]。但目前关于N-cadherin表达变化的具体机制以及在脑干胶质瘤中的表达报道较少。本研究首次从转录水平检测了脑干和幕上胶质瘤中N-cadherin mRNA的表达,发现在脑干和幕上胶质瘤中N-cadherin mRNA的表达无显著差异,而高级别脑干胶质瘤中N-cadherin mRNA表达量显著高于低级别脑干胶质瘤;临床研究表明,脑干胶质瘤绝大多数呈弥漫性生长;推测N-cadherin与脑干胶质瘤的病理分级及较强侵袭性关系密切。

β-catenin分子量为92 kDa,是原癌基因编码的黏附蛋白,主要调节细胞黏附系统,影响组织结构和形态发生;此外,β-catenin还是 Wnt信号传导通路的重要成分。有研究表明,β-catenin具有致癌作用,是癌细胞增殖的重要促进因子,随着胶质瘤恶性程度的增高,β-catenin的表达亦增高[8-9]。Pu等对45例不同级别的胶质瘤进行 RT-PCR检测,结果显示,β-catenin基因在各级胶质瘤中的mRNA表达无显著性差异[10]。本实验研究了脑干和幕上胶质瘤中β-catenin mRNA的表达,结果显示β-catenin mRNA在脑干胶质瘤中的表达显著高于幕上胶质瘤,提示β-catenin是导致脑干胶质瘤较幕上胶质瘤侵袭性较强的关键因素之一;此外,虽然在高低级别脑干胶质瘤中β-catenin mRNA的表达无显著差异,但β-catenin mRNA在高低级别脑干胶质瘤的表达均有增强的趋势,可能表明其与脑干胶质瘤的恶性增殖活性有关。但造成脑干胶质瘤预后差的主要原因是由于肿瘤本身的侵袭性还是其特殊的解剖结构遭到破坏所致,还需进一步研究。

细胞黏附性的改变是肿瘤侵袭与转移的重要始动环节。β-catenin与cadherin家族连接形成cadherincatenin功能复合体,调节细胞黏附系统。本实验结果显示,β-catenin与N-cadherin在脑干和幕上胶质瘤中的mRNA表达均呈正相关,提示N-cadherin-β-catenin复合体在脑干和幕上胶质瘤的恶性生物学行为中都起着重要作用。但N-cadherin与β-catenin在不同部位胶质瘤中表达为何差异较大,还需进一步研究。

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[5]Utsuki S,Oka H,Sato Y,et al.E,N-cadherins and beta-catenin expression in medulloblastoma and atypical teratoid/rhabdoid tumor[J].Neurol Med Chir(Tokyo),2004,44(8):402-407.

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