水溶性大豆多糖的提取工艺研究

王立峰，鞠兴荣，何 荣，刘 颖，耿 菁，袁 建

(1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210003；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

水溶性大豆多糖的提取工艺研究

王立峰1,2，鞠兴荣1，何 荣1,2，刘 颖1，耿 菁1，袁 建1

(1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210003；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

以脱脂豆粕为材料，对豆粕中水溶性大豆多糖的提取、纯化进行研究。通过酶提取效果选择，在木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶3种酶中选取提取效果最佳的碱性蛋白酶；通过从提取溶液的pH值、提取时间、料液比、酶的添加量及提取温度等因素的试验分析比较，得出大豆多糖的最优提取条件。结果表明：当提取溶液pH值、提取温度、提取时间和液料比分别为6.0、50℃、1.5h和20:1(mL/g)时，豆渣中大豆多糖的提取率可达到最大值17.92%，粗多糖的纯度为86.32%。

水溶性大豆多糖；酶法提取；纯化

水溶性大豆多糖是以大豆或大豆粕为原料，经脱脂、提取、脱色、纯化、干燥等工艺生产的水溶性多糖类物质。其主要成分的分子质量在6×105D左右，由半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、海藻糖、木糖以及葡萄糖等分子组成[1]。

水溶性大豆多糖具有多种生物活性，是一种天然的功能成分，可抑制脂类氧化[2]和稳定酸性饮料中的蛋白质[3]，它可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性。水溶性大豆多糖黏性低，可制成高浓度溶液，其溶液的黏度几乎不受盐类影响，对温度的热稳定性也优于其他糖类[4]。另外，干燥大豆多糖时，有强的黏附性，且能形成薄膜，所以大豆多糖可作为涂层材料使用[5]。水溶性大豆多糖有分散性、稳定性、乳化性和黏着性等多种功能，不仅能用作强化食品的膳食纤维素，还可以用于制药工业中[6]。

关于可溶性大豆多糖的提取，国内外已有很多报道。有的研究了在中性pH值条件下从热水中提取，有的在碱性条件用热水提取，有的还添加了络合剂，在酸性条件下提取[7]。Takahashi等[8]从大豆子叶中用中性热水提取大豆多糖，得率为38%。Kawamura等[9]则在热水中逐渐加入草酸铵和质量分数0.5% NaOH溶液，提取的大豆多糖得率为32%。碱水解法提取的大豆多糖为水不溶性，用氯乙酸对其结构进行化学改性获得的羧甲基大豆多糖具备水溶性和成膜性，有望在制备肠溶胶囊中部分取代褐藻胶。但是这些可溶性多糖多数是从大豆子叶或其他部位提取出来的，提取率不高，工艺比较复杂，成本也比较高。为开发水溶性大豆多糖的利用新途径，从豆渣中提取水溶性大豆多糖能提高豆渣的利用率，降低大豆产品的生产成本，具有良好的应用前景[10]。酶技术是一种新型高效绿色提取技术，具有快速、高效、反应温和、专一性强等诸多优点，酶法提取多糖也越来越得到广泛应用。何玉红[11]通过复配酶法从豆渣中提取水溶性大豆多糖。酶提法的优势越来越受研究者的关注，有很多关于各种酶在多种多糖提取中的应用的报道。本实验以脱脂豆粕为材料，对豆粕中水溶性大豆多糖的酶法提取、纯化等方面进行研究，增加企业效益和社会环境效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用东北优质大豆，于粉碎机中粉碎，将豆粕在索式抽提器上用石油醚(30～60℃沸程)于60℃对粉碎后的豆粕回流72h进行脱脂处理，处理后的脱脂豆粕放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全后放于旋风磨中磨成细小粉末，所得即为实验所需原料。

葡聚糖(MW500000) 美国Sigma公司；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶 丹麦Novozymes公司；柠檬酸三钠、无水硫酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、硫酸铜晶体、次氯酸钠、95%乙醇、苯酚、浓硫酸、丙酮、石油醚(30～60℃沸程)均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂；THZ-C恒温振荡器江苏太仓实验设备厂；pHS-3C精密数显pH计 上海精密科学仪器厂；UV-2401PC紫外分光光度计 日本岛津公司；减压过滤装置 江苏太仓实验设备厂；锤式旋风磨 上海安亭科学仪器厂；索氏抽提器 南京玻璃仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 葡聚糖标准曲线的测定[12]

精密吸取葡聚糖标准使用溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL(相当于葡聚糖0、0.04032、0.08064、0.12096、0.16128、0.2016mg)，分别置于25mL比色管中，定容至2.0mL，加入苯酚溶液2.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10mL，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度。

以葡聚糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘标准曲线，其回归方程Y=10.715X-0.1445，相关系数R2=0.9989。

1.3.2 样品中总糖量的测定

采用苯酚-硫酸比色法[13]测定大豆中多糖的含量，并以葡聚糖为标准品，通过已经测定的葡聚糖标准曲线计算大豆中的多糖含量。

1.3.3 大豆多糖的酶法提取

分别选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶，在各自的最适温度和pH值条件下，添加质量分数0.3%、液料比20:1(mL/g)，提取3h，测定多糖的纯度及提取率。依照1.3.2节测定提取出的大豆粗多糖的含量，根据3种酶提取出的大豆水溶性多糖的提取率和提取纯度，选择提取效果最佳的碱性蛋白酶进行正交试验。

1.3.4 酶法提取水溶性大豆多糖的正交试验设计

以提取溶液的pH值、提取温度、提取时间、液料比作为优选4因素，选用四因素三水平正交表L9(34)，各因素的水平根据所选用酶的最佳活性条件选定。

表1 复配酶提取正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction processing parameters using compound enzyme

1.3.5 水溶性大豆粗多糖的脱色[14]

向水溶性大豆多糖粗品中加入3倍体积的质量分数10%次氯酸钠溶液，并调节混合溶液至pH10～11范围内，在室温下搅拌40min，粗多糖脱色，将溶液倒入离心管中，置于离心机中(4000r/min)离心15min后，弃去上清液，得到沉淀。滤渣用热的去离子水洗至溶液呈中性，再置于离心机中(4000r/min)离心15min后，弃去上清液，得到沉淀。滤渣依次用95%乙醇和丙酮清洗一次，沥干，得到淡黄色水溶性大豆多糖，且略带香味。

1.3.6 水溶性大豆粗多糖的纯化[15]

将大豆水溶性粗多糖溶于适量蒸馏水中，加入1/5体积氯仿和1/15体积正丁醇，振荡一定时间后，使蛋白质与氯仿-正丁醇生成絮状凝聚物，用离心机(4000r/ min)离心15min除去沉淀。取离心后的上清液，加入3～5倍体积的95%乙醇沉淀，将沉淀液于4000r/min离心机中离心15min。倒出上清液，将沉淀用95%乙醇、丙酮依次洗涤，60℃真空干燥得到大豆多糖。

2 结果与分析

2.1 样品中多糖含量的确定

按照1.3.2节方法，对样品中多糖含量进行测定，得出样品中的多糖含量为20.82%。

2.2 提取条件对水溶性大豆多糖提取的影响

以水溶性多糖纯度为指标，多糖提取率为参考指标，对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行筛选，实验结果见表2。

表2 不同种类的酶对豆粕中多糖纯度及提取率的影响Table 2 Effect of enzyme type on extraction rate and purity of SSPS from soybean meal

由表2可知，碱性蛋白酶提取效果最好，所得的多糖纯度为84.0%，提取率达16.2%，其次为木瓜蛋白酶。因此，选择碱性蛋白酶进行水溶性大豆多糖的提取实验。

2.3 正交试验法确定水溶性大豆多糖的最佳提取条件以多糖纯度为指标，多糖提取率为参考指标，采用L9(34)来确定最佳条件。碱性蛋白酶提取正交试验因素与水平表见表1。正交试验及结果见表3。

表3 提取正交试验设计及结果Table 3 Design and results of orthogonal experiments for optimizing extraction processing parameters using compound enzyme

从多糖提取率来看，通过方差分析得出影响多糖提取率的因素按影响大小依次为B＞C＞A＞D。表明提取溶液的提取温度对大豆粕中水溶性大豆多糖的提取结果影响最大，其次是pH值和提取时间，液料比的影响最小。方差分析结果(表4)表明，提取溶液pH值、提取温度和提取时间对多糖提取率的影响达到显著水平，而液料比对多糖提取率的影响不显著，理论最佳工艺条件为A1B2C2D2，即碱性蛋白酶提取水溶性大豆多糖的最佳工艺条件为pH6.0、提取温度50℃、提取时间1.5h、液料比20:1(mL/g)。在此条件下，大豆粕中水溶性大豆多糖的提取率为17.92%。

表4 提取正交试验结果方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction processing parameters using compound enzyme

从多糖纯度来看，由方差分析的结果可知，影响多糖纯度的主次顺序为C＞A＞B＞D，即提取时间＞提取溶液pH值＞提取温度＞液料比，且提取时间对多糖提取纯度的影响达到极显著水平，提取溶液的pH和提取温度对多糖提取纯度的影响达到显著水平，而液料比对多糖提取纯度的影响不显著，其最佳组合为A2B3C2D2，即碱性蛋白酶提取水溶性大豆多糖的最佳工艺条件为提取溶液pH7.0、提取温度60℃、提取时间1.5h、液料比20:1(mL/g)。在此条件下，豆渣中水溶性大豆多糖的提取纯度为85.78%。

通过验证性实验，多糖提取率的正交试验中有A1B2C2D2，其值在9组试验中也是最大；多糖纯度的正交试验中无A2B3C2D2，以A2B3C2D2为条件测得多糖纯度为85.78%，与正交试验的9组试验比较，低于A1B2C2D2测得的多糖纯度86.32%。采用正交试验对豆渣中水溶性大豆多糖的提取过程进行研究，结果从表4可以直观看出，2号试验A1B2C2D2多糖的提取率和提取纯度都是最高的，所以在提取过程中的优化条件为提取溶液pH6.0、提取温度50℃、提取时间1.5h、液料比20:1(mL/g)的情况下可以得到最佳效果。

3 结 论

本实验以大豆粕为原材料，通过单因素实验和正交试验分别确定了酶法提取水溶性大豆多糖的酶的种类和研究了提取溶剂的pH值、提取温度、提取时间、料液比等对水溶性大豆多糖的提取量变化的影响，结果表明：在提取溶剂pH值、提取温度、提取时间和液料比分别为6.0、50℃、1.5h和20:1(mL/g)时，大豆中水溶性大豆多糖的提取率可达到最大值17.92%，同时多糖的纯度达到了86.32%。

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Extraction Processing of Soluble Soybean Polysaccharides

WANG Li-feng1,2，JU Xing-rong1，HE Rong1,2，LIU Ying1，GENG Jing1，YUAN Jian1
(1. Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Soybean meal was used as the experimental subject to explore the extraction and purification of soluble soybean polysaccharides (SSPS). During the choice of enzyme, alkali protease exhibited the best enzymatic extraction efficiency among papain, alkali protease and complex protease. The optimal extraction conditions of SSPS were explored by evaluating the effects of extraction pH, extraction time, material-liquid ratio, enzyme addition amount and extraction temperature on extraction rate. Results indicated that the optimal extraction conditions were extraction pH of 6.0, extraction temperature of 50 ℃, extraction time of 1.5 h and material-liquid ratio of 1:20. Under these optimal extraction conditions, extraction rate of SSPS was up to 17.92 % and the purity of SSPS was 86.32%.

soluble soybean polysaccharides (SSPS)；enzymatic extraction；purification

TQ936.16

A

1002-6630(2010)24-0111-04

2010-08-19

江苏省教育厅产业化推进项目(JH09-2)

王立峰(1977—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为食品营养及功能性成分。E-mail：wanglifeng_8@163.com