多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用

徐义刚，崔丽春*，李苏龙，曹际娟，姜艳春，张子群，刘新亮

(1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江 哈尔滨 150001；2.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116065)

多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用

徐义刚1，崔丽春2,*，李苏龙1，曹际娟3，姜艳春1，张子群1，刘新亮1

(1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江 哈尔滨 150001；2.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116065)

肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)是引起腹泻、危害食品安全和人类健康的4种主要大肠杆菌。本实验基于ETEC LT基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵袭性质粒基因序列，设计了4对特异性引物，利用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)技术，通过体系优化，建立了致腹泻性大肠杆菌多重PCR-DHPLC检测方法，达到同时检测4种致病菌的目的。该方法灵敏度高，最低检测限为EHEC 6×101拷贝/μL、ETEC 1.3×102拷贝/μL、EPEC 9×101拷贝/μL、EIEC 7×101拷贝/μL。特异性试验表明，对22种共41株细菌进行检测，所试6株致腹泻性大肠杆菌均为阳性。实践证明，该方法具有良好的实用性，可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的单一或混合感染的检测。

致腹泻性大肠杆菌； 聚合酶链式反应；变性高效液相色谱；检测

微生物污染是影响我国食品安全最突出的因素之一。大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli) 也称大肠杆菌，与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致腹泻性大肠杆菌，常引起严重腹泻和败血症[1-2]。致腹泻性大肠杆菌按其生物学特性主要分为四类[3-4]：产肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC)，在食品卫生与食品安全检测方面具有重要的意义。

ETEC主要感染儿童和旅游者，发展中国家尤为严重，被污染的水和食物是主要传染源，主要致病因素是大肠杆菌肠毒素LT或ST[5]，感染的临床症状轻度时为温和性腹泻，严重时可发展为霍乱样腹泻症状[6]。EPEC是婴儿腹泻的主要病原菌，具有高度传染性，严重者可致死，病原菌主要感染肠上皮细胞形成特征性的组织病理损伤[7]。EIEC主要引起大龄儿童和成年人腹泻，曾爆发流行，临床症状为水样腹泻，有时呈现痢疾症状[8]。EHEC主要血清型是O157:H7，引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素[9]。

目前我国致腹泻性大肠杆菌的检测方法主要采用国标法(GB 4789.6—1994《食品卫生微生物学检验——致泻大肠埃希氏菌检验》)，检测程序为样品→增菌→分离培养→革兰染色镜检/生化及菌落观察/生化反应试验/肠毒素检查等，操作复杂繁琐，检测时间长，需要4～7d，且检测单一。变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的基因高通量分析技术，利用核酸分子通过固定相亲和力的差异，用流动相洗脱时，不同大小或者不同序列的核苷酸片段在固定相上移动速率不同而达到分离的目的，具有全自动、高通量检测的特点。在国内外的医学、遗传学方面逐渐得以应用，如SNP分析、双链DNA片段分析、微卫星分析、mRNA定量分析、引物纯度检测等[10-14]。因此，可利用DHPLC区分不同长度DNA片段的特点，根据不同致病菌特有基因序列，设计引物进行PCR扩增，用DHPLC分析检测，达到快速、高通量检测食品中病原微生物的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

大肠杆菌ATCC 25922、肠出血性大肠杆菌 O157: H7 ATCC 35150、产肠毒素大肠杆菌ATCC 35401、侵袭性大肠杆菌ATCC 43893、肠致病性大肠杆菌ATCC 11775、阪崎肠杆菌ATCC 51329、单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、绵羊李斯特氏菌ATCC 33090、嗜水气单胞菌ATCC 7966、空肠弯曲菌ATCC 33560、类志贺邻单胞菌ATCC 14030、普通变形杆菌ATCC49027、猪霍乱沙门氏菌ATCC 10708、福氏志贺氏菌ATCC 12022、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、霍乱弧菌ATCC 14035、副溶血性弧菌ATCC 27519、溶藻性弧菌ATCC33839、创伤弧菌ATCC 33149和小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 9610来自美国典型菌种保藏中心(ATCC)；溶血性链球菌CMCC32121来自中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)；分离株由本技术中心实验室分离保存。

1.1.2 试剂

Taq DNA Polymerase NEB公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 TaKaRa公司；复合增菌培养基BPW北京兰伯瑞生物技术公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯) Transgenomic公司；乙腈(色谱纯) Fisher公司。1.2仪器与设备

PCR扩增仪 Eppendorf公司；凝胶成像仪 GE公司；电泳仪 Bio-Rad公司；Wave 4500系统、C18DNASep 色谱柱(4.6 mm×50 mm，3μm) Transgenomic公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

根据Genbank中EHEC O157:H7 O抗原基因、ETEC LT基因、EPEC bfpA基因和EIEC侵袭性质粒基因，利用引物设计软件Primer5.0 设计4对PCR引物，引物由TaKaRa公司合成。

1.3.2 细菌培养及基因组DNA提取

将菌株分别接种于5mL复合培养基BPW中，按照每种细菌最适生长温度培养过夜，利用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体操作步骤详见使用说明书。

1.3.3 PCR反应条件

单重PCR反应体系(25μL)：10×PCR缓冲液2.5μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL、模板DNA 1μL，去离子水补充至25μL。单重PCR反应条件：95℃变性5min；95℃变性15s、60℃退火20s、72℃延伸60s，进行35个循环。多重PCR反应体系(25μL)：10×PCR缓冲液2.5μL、多重PCR引物(10μmol/L)浓度比ETEC: EHEC:EIEC:EPEC=1:1:1.3:1、dNTPs(10mmol/L)4μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)1μL、模板DNA 各1μL，去离子水补充至25μL。多重PCR反应条件：95℃变性5min；95℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸60s，进行40个循环。

表1 PCR引物序列Table1 Primers designed in this study for PCR amplification

1.3.4 DHPLC检测条件

PCR产物上样量5μL；柱温50℃；流速0.9 mL/min；缓冲液洗脱梯度A：42%～58%，B：58%～42%；洗脱时间10min(A：50mL TEAA、250μL乙腈，去离子水定容至1000mL；B：50mL TEAA、250mL乙腈，去离子水定容至1000 mL)；洗脱的DNA在260nm进行紫外吸收检测。

1.3.5 特异性实验

试剂盒法提取1.1.1节中细菌的基因组DNA，利用建立的PCR-DHPLC方法进行检测，以验证方法的特异性。

1.3.6 灵敏度实验

将4种致腹泻性大肠杆菌的PCR产物克隆作为阳性质粒，260nm测定OD值，计算初始基因拷贝数，用去离子水进行10倍系列稀释，取各稀释度样品5μL，以测试该方法的检测灵敏度。

1.3.7 验证实验

将建立的检测方法应用于检验检疫实践工作中，其结果与GB 4789.6—1994进行比较，验证该方法的可靠性。

2 结果与分析

2.1 单重PCR-DHPLC检测结果

图1 致腹泻性大肠杆菌单重PCR检测结果Fig.1 Results of single PCR detection of four diarrheogenic E.coli strains

图2 致腹泻性大肠杆菌单重PCR扩增产物DHPLC检测结果Fig.2 Results of DHPLC detection of single PCR amplification products of four diarrheogenic E.coli strains

基于4种致腹泻性大肠杆菌特异性基因序列，设计了4对PCR扩增引物，通过反应体系及反应条件的优化，建立单重PCR方法，该方法能够有效扩增出4种致病菌目的基因片段(图1)。采用DHPLC技术检测PCR产物(图2)，结果显示该技术能够将片段大小不同的4种致病菌的PCR产物根据出峰时间的不同有效区分开。

2.2 多重PCR-DHPLC检测结果

在单重PCR基础上，经过反应体系和反应条件的优化，建立了4种致腹泻性大肠杆菌多重PCR方法(图3)。多重PCR产物经变性高效液相色谱技术检测，结果见图4，利用变性高效液相色谱技术能够一次性检测出片段大小不同的4种致病菌的PCR产物，根据出峰时间的不同有效的区分开。

图3 致腹泻性大肠杆菌多重PCR检测结果Fig.3 Results of multiplex PCR detection of four diarrheogenic E.coli strains

图4 致腹泻性大肠杆菌多重PCR扩增产物DHPLC检测结果Fig.4 Results of DHPLC detection of multiplex PCR amplification products of four diarrheogenic E.coli strains

2.3 特异性实验结果

利用建立的检测方法对表2中的细菌进行检测，结果显示，肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌和产肠毒性大肠杆菌等4种致腹泻性大肠杆菌均为阳性，其他菌株为阴性，说明本研究所建立的检测方法具有高度特异性。

2.4 灵敏度实验

表2 特异性实验结果Table2 Results of specificity evaluation

将4种致腹泻性大肠杆菌的PCR产物克隆至质粒，作为阳性对照样品，测定OD260值，计算初始基因拷贝数，然后将其进行10倍系列稀释，取各稀释度样品5μL，用建立的检测方法进行检测，以测试其检测灵敏度。结果显示该方法对4种致病菌的检测灵敏度分别为EHEC 6×101拷贝/μL、ETEC 1.3×102拷贝/μL、EPEC 9×101拷贝/μL和EIEC 7×101拷贝/μL。

2.5 实践应用

表3 多重PCR-DHPLC检测方法的实践应用Table3 Applications of the developed PCR/DHPLC method

2009年1～11月期间，利用建立的多重PCR-DHPLC检测方法对市场流通的各种肉类、奶类制品及人工污染食品样品进行检测，同时采用国标法(GB 4789.6—1994)进行验证，结果见表3所示，共检出阳性样本42份，与国标法检出结果相符合，说明所建立检测方法切实可行，同时也反映出食品受到致腹泻性大肠杆菌污染的普遍性。

3 结 论

食品安全是全球性的重大公共卫生问题， 每年因食源性微生物污染引起的腹泻病例达数亿起，死亡的0～15岁儿童约170万人[15]。其中，致腹泻性大肠杆菌是重要的病原之一，特别是婴幼儿腹泻，在我国及国外腹泻患者中致腹泻性大肠杆菌的检出率、构成比、优势类型及血清型不同[16-20]，给临床诊断带来不便。本研究针对4种主要的致腹泻性大肠杆菌特异性靶基因，利用聚合酶链式反应(PCR)和变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立的多重PCR-DHPLC检测方法，可一次性检出4种致腹泻性大肠杆菌病原菌单一感染或混合感染，实现通量检测。该多重PCR-DHPLC方法比常规的细菌分离鉴定敏感度高，检测快速，通量高，同时避免了PCR方法产物经琼脂糖凝胶电泳检测EB对人体和环境带来的潜在危害。该方法可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，对保障食品安全和人类健康具有现实意义。

[1]孙贵娟, 林毓宁, 邓其军, 等. 南宁致泻性大肠杆菌病原监侧与研究[J]. 广西医学, 2000, 22(4): 684-686.

[2]陈萍, 李泽鸿, 邴伟. 致泻性大肠杆菌研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2007(4): 11-13.

[3]RODRIGUEZ-ANGELES G. Principal characteristics and diagnosis of the pathogenic groups of Escherichia coli[J]. Salud Publica Mex, 2002, 44(5): 464-475.

[4]NATARO J P, KAPER J B. Diarrheagenic Escherichia coli[J]. Clin Microbiol Rev, 1998, 11(1): 142-201.

[5]LEVINE M M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent [J]. J Infect Dis, 1987, 155(3): 377-389.

[6]QADRI F, SVENNERHOLM A M, FARUQE A S G, et al. Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention[J]. Clin Microbiol Rev, 2005, 18(3): 465-483.

[7]TORRES A G, ZHOU X, KAPER J B. Adherence of diarrheagenic Escherichia coli strains to epithelial cells[J]. Infect Immun, 2005, 73(1): 18-29.

[8]LAN R, ALLES M C, DONOHOE K, et al. Molecular evolutionary relationships of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella spp[J]. Infect Immun, 2004, 72(9): 5080-5088.

[9]ROWE P C, ORRBINE E, OGBOM M, et al. Epidemic Escherichia coli O157:H7 gastroenteritis and hemolytic-uremic syndrome in a Canadian Inuit community: intestinal illness in family members as a risk factor[J]. J Pediatr, 1994, 124: 21-26.

[10]HANNACHI M, AMBLER J E, TAYLOR C F, et al. Examination of single and multiple mutations involved in resistance to quinolones inStaphylococcus aureus by a combination of PCR and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)[J]. J Antimicrob Chemother, 2002, 50(5): 649-655.

[11]EAVES D J, LIEBANA E, WOODWARD M L, et al. Detection of gyrA mutations in quinolone-resistant Salmonella enterica by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40 (11): 4121-4125.

[12]BARLAAN E A, SUGIMORI M, FURUKAWA S, et al. Profiling and monitoring of microbial populations by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Microbiol Methods, 2005, 61(3): 399-412.

[13]HURTLE W, SHOEMAKER D, HENCHAL E, et al. Denaturing HPLC for identifying bacteria[J]. Biotechniques, 2002, 33(2): 386-391.

[14]HURTLE W, BODE E, KAPLAN R S, et al. Use of denaturing highperformance liquid chromatography to identify Bacillus anthracis by analysis of the 16S-23S rRNA interspacer region and gyrA gene[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(10): 4758-4766.

[15]张红波. 我国食品安全现状分析及其对策[J]. 中国安全科学学报, 2004, 14(1): 15-17.

[16]赵瑞珍, 李连青, 朱庆义等. 产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌性小儿腹泻[J]. 中华儿科杂志, 2006, 44(2): 136-137.

[17]张道玲, 邵长喜. 感染性腹泻病原菌调查分析[J]. 中国自然医学杂志, 2005, 7(2): 83.

[18]凌苏, 赵星祥, 华冰等. 感染性腹泻病原菌及药敏分析[J]. 中华传染病杂志, 2005, 23(5): 347-348.

[19]KEBEDE A, POLDEMAN A M. Etiology of acute diarrhea in adults in southwestern nigeria[J]. J Clin Microhiol, 2004, 42(8): 3909-3910.

[20]KESKIMAKI M, MATTILA L, PELTOLA H, et al. Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in finns with or without diarrhea during a round-the-world trip[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(12):4425-4429.

Development and Application of a Multiplex PCR/DHPLC Method for Detecting Four Common Diarrheogenic Escherichia coli Strains

XU Yi-gang1，CUI Li-chun2,*，LI Su-long1，CAO Ji-juan3，JIANG Yan-chun1，ZHANG Zi-qun1，LIU Xin-liang1
(1. Technical Centre, Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China；2. Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；3. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116065, China)

Four pairs of specific primers were designed according to the sequences of the LT gene from enterotoxigenic E.coli (ETEC), the bfpA gene from enteropathogenic E.coli (EPEC), the O antigen gene from enterohemorrhagic E.coli (EHEC) and the invasive plasmid gene from enteroinvasive E.coli (EIEC) for the development of a multiplex polymerase chain reaction/denaturing high performance liquid chromatography (PCR/DHPLC) method for the simultaneous detection of the four common diarrheogenic E.coli strains. The PCR/DHPLC method had high sensitivity and its detection limit was 6×101copies/μL for EHEC, 1.3×102copies/μ L for ETEC, 9×101copies/μ L for EPEC and 7×101copies/μ L for EIEC. The specificity evaluation showed that 6 of 41 stains from 22 species were determined to be positive. This method proves to be applicable and suitable for the detection of infection with one or more of the four E.coli strains.

diarrheogenic E.coli；PCR；DHPLC；detection

R155.1；R378.2.1

A

1002-6630(2010)20-0293-05

2010-02-08

黑龙江省青年基金项目(QC2009C90)；黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z09)

徐义刚(1978—)，男，兽医师，博士，研究方向为病原微生物诊断与防治。E-mail：yigangxu_china@yahoo.com.cn

*通信作者：崔丽春(1977—)，女，副研究员，博士，研究方向为微生物学。E-mail：degree82191656@yahoo.com.cn