高效毛细管电泳法在黄酮类化合物分析检测中的应用

周一鸣，周小理,*，崔琳琳

(1.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 200235；2.上海商学院食品工程系，上海 200235)

高效毛细管电泳法在黄酮类化合物分析检测中的应用

周一鸣1，周小理1,*，崔琳琳2

(1.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 200235；2.上海商学院食品工程系，上海 200235)

建立一种高效毛细管电泳(HPCE)法测定黄酮类化合物含量的方法。电解质溶液以20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)作为缓冲液，在25℃、20kV压力条件下进行电泳，245nm波长处检测，线性关系良好，在10min内黄酮类化合物完全分离，符合定性研究和定量测定的要求。该方法具有较好的分离效果和良好的精密度，可应用于黄酮类化合物的测定。

黄酮类化合物；高效毛细管电泳

高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE) 是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为主要驱动力的液相分离技术。相比传统电泳和高效液相色谱(HPLC)，它具有高效、快速、高灵敏度、高度自动化等特点，并且所需样品量和溶剂消耗少、运行成本低、对环境污染小[1]。在一台HPCE仪器上可兼容多种分离模式，因此适用样品范围广，已被广泛应用于生物、化学、医药、食品、环保等领域[2-5]。

芦丁和槲皮素作为两种重要的黄酮类化合物，在植物中大量存在，目前对其分析测定方法有高效液相色谱法、荧光光谱法、化学发光法等[6]。但采用高效毛细管电泳法[7-15]同时检测此两种物质未见有报道。本实验以荞麦芽粉为对象，采用高效毛细管电泳法一次同时分离测定出其中芦丁和槲皮素的含量，效果良好，可为今后测定植物样品中黄酮类化合物(含黄酮类化合物的营养食品)提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

荞麦 市购。

芦丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin)对照品 Sigma公司；其他试剂均为分析纯；水为二次重蒸水。

CL3030型高效毛细管电泳仪 北京彩陆科学仪器有限公司；未涂层弹性石英毛细管柱(50cm×50cm，75μm，有效长度40cm) 河北永年光导纤维厂；电子天平、pH计 Metiler Toledo公司；超声波清洗器 昆山超声波有限公司。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁10.8mg、槲皮素9.9mg，分别用甲醇溶解并定容至10mL，得到芦丁标准液的质量浓度为1.08mg/mL，槲皮素标准液的质量浓度为0.99mg/mL。精密称取桑色素7.8mg，用甲醇定容至25mL，得到桑色素标准液的质量浓度为0.312mg/mL。

1.2.2 样品溶液制备

荞麦芽经冷冻干燥后粉碎，在60℃条件下干燥至质量恒定。精密称取荞麦芽粉样品1.0g，放入三角瓶中，加入甲醇20mL，称量。超声提取40min，擦净瓶外壁水，冷却至室温后称量，用甲醇补足质量损失。过滤，取滤液，3000r/min离心3min后进行HPCE检测。

1.2.3 电泳条件

该条件为根据预实验确定的最佳条件。以20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)为电泳缓冲液，未涂层弹性石英毛细管，20kV恒压条件下电泳分离，245nm处检测。所有溶液使用前使用0.45μm滤膜过滤，每次运行后依次以0.10mol/L NaOH溶液、超纯水和电泳缓冲液分别冲洗5min。所有实验均在室温条件下进行。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

精密称取芦丁标准品10.8mg、槲皮素标准品9.9mg，分别用甲醇溶解并定容至10mL，得到芦丁标准液的质量浓度为1.08mg/mL，槲皮素标准液的质量浓度为0.99mg/mL。分别取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL的标准溶液，定容到10mL，得到6个质量浓度水平。以峰面积为纵坐标(y)、标准品含量为横坐标(x)建立标准曲线。

表1 标准曲线回归方程、线性范围和最低检测限和定量限Table1 Figures of merit of standard curves as well as limits of detection and quantification of rutin and quercetin

由表1可知，本方法对照品溶液吸取量在0.1～5.0mL之间时，测试结果与被测物质质量浓呈良好线性关系，因此，本方法可作为荞麦芽粉芦丁和槲皮素含量的测定方法。图1表明该方法有良好的检出效果。

图1 混标(A)和荞麦(B)的HPEC图谱Fig.1 HPEC chromatograms of mixed rutin and quercetin standards and flavonoid compounds extracted from buckwheat sprouts

2.2 稳定性实验

取制备好的荞麦芽粉提取液样品，于0、12、24、36、48、72h分别进样，重复6次，记录芦丁和槲皮素的峰面积，根据标准曲线计算芦丁、槲皮素含量分别为6.40mg/g和5.19mg/g，相对标准偏差分别1.9%和1.5%。

2.3 精密度实验

取制备好的荞麦芽粉提取液样品，重复进样6次，记录芦丁和槲皮素的峰面积，根据标准曲线计算芦丁、槲皮素含量分别为6.58mg/g和5.47mg/g，相对标准偏差分别为1.7%和2.1%。可知用HPCE法测定荞麦芽中黄酮化合物含量，结果变异系数较小，说明该方法的重现性准确性良好，且测定条件易控制，测定结果较满意。

2.4 重复性实验

取同一批的荞麦芽粉提取液样品，重复进样5次，记录芦丁和槲皮素的峰面积，根据标准曲线计算芦丁、槲皮素含量分别为6.76mg/g和5.28mg/g，相对标准偏差分别为2.3%和2.0%。

2.5 加样回收率实验

表2 荞麦芽中黄酮化合物含量测定的回收率实验Table2 Spike recoveries of the method for rutin and quercetin

采用加样回收率法，精密称取1.0g荞麦芽粉，加入芦丁和槲皮素标准溶液各5mL，用1.2.2节方法进行提取检测，记录芦丁和槲皮素的峰面积，计算回收率及相对标准偏差，回收率实验结果如表2所示。平均回收率分别为91.9%和96.0%，RSD为2.1%和2.8%，测定的结果与真实值接近的程度较好，准确度较高。因此以芦丁、槲皮素为对照品，利用HPCE法测定荞麦芽粉中黄酮化合物含量符合微量成分分析要求，具有较好的应用价值。

3 结 论

本实验建立测定荞麦芽粉中芦丁、槲皮素黄酮类化合物含量的高效毛细管电泳法，经过方法学验证得知，本法线性关系良好、重现性好、稳定性可靠、回收率高，方法简单可靠，为实现快速、准确测定植物样品中黄酮类化合物含量提供了一种新的方法。

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Application of High Performance Capillary Electrophoresis to the Determination of Flavonoid Compounds

ZHOU Yi-ming1，ZHOU Xiao-li1,*，CUI Lin-lin2
(1. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200235, China；2. College of Food Science, Shanghai Business School, Shanghai 200235, China)

A method was developed for the determination of flavonoid compounds using high performance capillary electrophoresis (HPCE). The electrolyte buffer used was 20 mmol/L borax/boracic acid solution (pH 8.4). Electrophoresis was performed at 25 ℃ and 20 kV voltage. The detection wavelength was set as 245 nm. The developed method displayed good linearity. A thorough chromatographic separation of flavonoid compounds was achieved within 10 min, which meets the requirements for qualification and quantification. This method giving good separation and having high precision is applicable for the determination of flavonoid compounds in practice.

flavonoids；high performance capillary electrophoresis (HPCE)

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0275-03

2009-11-26

国家自然科学基金项目(31071527)；上海市优秀青年基金项目(yyy09013)；上海市科委重点科技攻关项目(074905114)；“十一五”国家科技支撑计划项目子课题(2006BAD02B06/18)

周一鸣(1981—)，男，助教，硕士，研究方向为天然产物开发与利用。E-mail：zhouym@sit.edu.cn

*通信作者：周小理(1957—)，女，教授，研究方向为食品新资源深度开发与利用。E-mail：zhouxl@sit.edu.cn