槟榔中槟榔碱的乙醇回流提取工艺研究

罗士数，张海德*，朱 莉，刘小玲

(海南大学食品学院，海南 海口 570228)

槟榔中槟榔碱的乙醇回流提取工艺研究

罗士数，张海德*，朱 莉，刘小玲

(海南大学食品学院，海南 海口 570228)

采用加热回流提取法从槟榔中提取槟榔碱。以槟榔碱得率为考察指标，用高效液相色谱法测定其含量，在单因素试验基础上，采用L9(34)正交试验得出槟榔中槟榔碱的最佳提取工艺：乙醇体积分数85%、料液比1:14 (g/mL)、提取温度85℃、碱化pH8。此条件下槟榔碱得率为(0.251±0.03)%。

槟榔；槟榔碱；回流提取工艺

槟榔(Areca nut)是棕榈科植物槟榔的干燥成熟种子，在我国已有1500多年的栽培历史[1]。槟榔作为一种常用中药，位居我国著名四大南药之首，是54种棕榈科植物中唯一一种含有生物碱的植物[2]。槟榔的药用价值很高，中医用作治疗虫积、食滞、腹胀痛、水肿、脚气等症，在临床上也常用于驱虫、抗菌、治疗胃病、十二指肠溃疡等。槟榔碱是槟榔的主要保健和药理活性成分，具有一定的药用价值。

槟榔碱是中药槟榔饮片和焦槟榔的主要活性成分[3]，它是槟榔的有效驱虫成分，对猪肉、牛肉绦虫有较强的致瘫痪作用，对棘球蚴虫有杀伤作用[4]，对钉螺也有显著的杀灭作用[5]。Lim等[6]指出：槟榔碱可以通过类胆碱功能受体的激活作用剂量，依赖性地抑制大鼠离体肾上腺体中儿茶酚胺的释放。近年来的研究亦表明，槟榔是具有开发前景的中药，其主要有效成分槟榔碱被证实对小肠运动具有一定的促进作用[7]，以及抗血栓作用[8]、抗动脉粥样硬化[9]、抗胃溃疡作用[10]、防止心脑血管疾病[11]、适量可以缓和血管紧张[12]、改善记忆力[13]、降低血糖[14]、改善老年痴呆症[15]等药理保健功效。但是目前临床上还没有槟榔碱制成的有效制剂。因此，研究槟榔碱的提取方法及条件对于槟榔药用价值的开发具有一定的指导意义。

本研究对槟榔中槟榔碱进行回流提取，采取高效液相色谱法测定，以槟榔碱的含量为指标，并在单因素试验的基础上，通过正交试验得出最佳提取工艺条件。这对中国热带地区丰富的槟榔资源的综合开发利用、提高槟榔产品附加值、促进槟榔产业发展等均有重大意义，并为扩大槟榔碱新药源提供参考，以及槟榔碱的工业化生产提供基础性研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槟榔鲜果采自海南大学(儋州校区)热带植物园内，为海南品种，取槟榔壳和籽45℃烘干至质量恒定，粉碎过筛，即为槟榔壳和槟榔籽原料。

无水乙醇、氯仿、浓氨水、氢溴酸、无水硫酸钠(均为分析纯) 广州化学试剂厂；甲醇(色谱纯)美国天地公司；氢溴酸槟榔碱标准品(纯度99.5%) 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AT型高效液相色谱仪(配有SPD-20A紫外检测器和Lcsolution色谱工作站) 日本岛津公司；CS101-II型电热鼓风干燥箱 重庆实验设备厂；HH-S21A型数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；RE52CS-2型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；A11型粉碎机 德国IKA公司；PB3002-N型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

称取槟榔原料5.00g，量取一定量一定体积分数的乙醇溶液加入其中，控制一定的水浴温度加热回流提取。提取一定时间后，滤取提取液，残渣再如上法提取2次。合并3次滤液，进行减压浓缩，回收乙醇，浓缩至浸膏状之后，加体积分数5%的稀HCl溶解，充分摇匀后过滤。滤液逐滴加入体积分数36%的浓氨水调节p H值，并搅拌。在碱化液中加入氯仿，充分搅匀，装入分液漏斗，待静置分层后，放出氯仿层，再用氯仿反复萃取3～5次。合并萃取液，加适量无水硫酸钠脱水过滤。滤液再减压浓缩，回收氯仿与氨水的混合液，至浸膏状后迅速将其溶于无水乙醇中，冷却后滴加体积分数5%的氢溴酸调节pH值，加适量无水硫酸钠脱水过滤，即得到槟榔碱的乙醇溶液，再将其放于水浴锅上蒸干(温度不超过50℃)，蒸干后加甲醇定容至25mL，再吸取2mL定容至10mL，供色谱检测用。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱Shim-pack VP-ODS(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为甲醇:0.1%(V/V)磷酸=9:1(V/V)；流速0.5 mL/min；检测波长215nm；柱温：室温(25～30℃)；进样量10μL。采用外标面积归一法测得样品含量[16]。

1.3.2.2 标准液的制备

准确称量槟榔碱标准品42.02mg，加甲醇定容至25mL，再吸取5mL定容至25mL，即得到质量浓度为0.336mg/mL的槟榔碱标准品溶液。

1.3.2.3 标准曲线的绘制

从已配制的标准液中分别吸取8、6、4、2、0mL，用甲醇定容至10mL，质量浓度分别是0.2688、0.2016、0.1344、0.0672、0mg/mL。以峰面积为横坐标，槟榔碱质量浓度(mg/mL)为纵坐标，得标准曲线(图1)，其线性回归方程：Y=2.830×10-8X－1.058× 10-2，R2=0.9999。

图1 槟榔碱标准曲线Fig.1 Standard curve of arecoline

1.3.3 数据分析及槟榔碱得率的计算

使用Excel软件对数据进行分析处理，每组试验均重复3次，实验数据表示为x±s。

槟榔碱提取得率/%=m/m0×100

式中：m为高效液相色谱法测定并计算得到的提取物中槟榔碱质量/g；m0为原料质量/g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 槟榔粉碎粒度的选择

选择提取时间1h、提取溶剂为50mL 75%乙醇溶液、提取温度85℃、碱化pH10，测定槟榔碱得率，对槟榔果不同部位和不同粉碎度进行试验。其结果见图2。

图2 槟榔果壳和籽的槟榔碱得率Fig.2 Comparison on extraction rates of arecoline from different parts of betel nut

从图2可以看出，槟榔壳的槟榔碱得率要高于槟榔籽，而且原料粉碎粒度在过20～60目筛范围内，随着粉碎粒度的减小槟榔碱得率逐渐增大，而在过80目筛后槟榔碱得率反而降低。原因可能是粉碎粒度太细导致原料表面张力增大，不利于有效成分的溶出。故原料粉碎粒度选择过60目筛为宜。

2.1.2 提取溶剂的选择

槟榔碱及其盐都能溶于甲醇和乙醇。甲醇的沸点比乙醇低，极性比乙醇大，对生物碱盐类的溶解性能也比乙醇好，但它对视神经的毒性很大，所以多数用乙醇作为提取溶剂。

称取研碎的槟榔壳粉末5.00g，按料液比1:10(g/mL)分别加入体积分数45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后残渣再如上法提取3次，碱化pH10，测定槟榔碱得率，结果见图3。

图3 乙醇体积分数对槟榔碱得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of arecoline

从图3可以看出，槟榔碱的得率在45%～85%体积分数范围内呈上升趋势，85%时达到最大，至体积分数为95%时得率反而减小，但下降幅度不大，原因是高体积分数的乙醇把其他脂溶性杂质成分提取出来，影响了槟榔碱的溶出。故可选择乙醇体积分数85%为最佳。

2.1.3 料液比对槟榔碱得率的影响

称取研碎的槟榔壳粉末5.00g，分别按料液比1:8、1:10、1:12、1:14、1:16(g/mL)加入85%乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后残渣再如上法提取3次，碱化p H 1 0，测定槟榔碱得率，结果见图4。

图4 料液比对槟榔碱得率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of arecoline

从图4可以看出，随着溶剂量的增大，槟榔碱得率也越大。其原因是溶剂量越多，溶剂与浸提物的接触越充分，能在相同时间内溶解出更多的槟榔碱，使得率增大。当料液比达到1:14(g/mL)时，槟榔碱得率增加不明显，说明槟榔碱的溶解已基本饱和。故选择料液比1:14(g/mL)为最佳。

2.1.4 提取次数的选择

称取研碎的槟榔壳粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后残渣再如上法分别提取0、1、2、3、4次，即提取次数分别为1、2、3、4、5次，碱化pH10，测定槟榔碱得率，结果见图5。

图5 提取次数的选择Fig.5 Effect of extraction number on extraction rate of arecoline

从图5可以看出，当提取1～3次时，随着提取次数的增加，提取得率逐渐增加，当提取大于3次时，槟榔碱得率增加不明显，表明槟榔碱已提取完全，因此重复提取3次即可。

2.1.5 碱化pH值对槟榔碱得率的影响

称取研碎的槟榔壳粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后残渣再如上法提取2次，碱化时分别调pH6、7、8、9、1 0、1 1，测定槟榔碱得率，结果见图6。

图6 碱化pH值对槟榔碱得率的影响Fig.6 Effect of pH on extraction rate of arecoline

从图6可以看出，碱化pH值对槟榔碱得率的影响较为明显，当碱化pH值小于8时，得率随着pH值的增大而明显增加，其原因是与鞣酸结合的槟榔碱在加入了浓氨水后不断被游离出来。当pH值大于8时，槟榔碱得率逐渐下降，其原因可能是槟榔碱在碱性条件下水解生成甲醇和槟榔次碱的缘故。故最佳pH值为8。

2.1.6 提取时间的选择

称取研碎的槟榔壳粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，在85℃水浴中分别回流提取0.5、1、1.5、2、2.5h，提取完后残渣再如上法提取2次，碱化pH8，测定槟榔碱得率，结果见图7。

图7 提取时间的选择Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of arecoline

从图7可以看出，当提取时间小于1h时，槟榔碱得率呈上升趋势，当大于1 h后，变化趋于平缓，说明提取1h可将槟榔碱提取完全。从节省时间角度考虑，选择1h为最佳提取时间。

2.1.7 提取温度的选择

称取研碎的槟榔壳粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，分别在45、55、65、75、85、95℃水浴中回流提1h，提取完后残渣再如上法提取2次，碱化p H 8，测定槟榔碱得率，结果见图8。

图8 提取温度的选择Fig.8 Effect of extraction temperature on extraction rate of arecoline

从图8可以看出，在45～85℃温度范围内，槟榔碱得率随着温度的升高而显著增大，这是因为温度的升高有助于传质过程，使分子扩散运动激烈，加快槟榔碱在溶液中扩散和乙醇的渗透，同时提取液黏度随温度升高而降低，从而使槟榔碱溶出速度加快。温度大于85℃后槟榔碱得率增加不明显。故选择85℃为最佳。2.2正交试验设计及结果

表1 因素水平表Table1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 槟榔碱提取正交试验结果与分析Table2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取温度(C)、碱化pH值(D)4因素，各取3水平(表1)，按正交设计表L9(34)安排试验。按1.3.2节方法测定槟榔碱得率。正交试验设计及结果见表2，试验方差分析结果见表3。

表2结果表明，各因素对槟榔碱得率影响大小次序为乙醇体积分数＞碱化pH值＞料液比＞提取温度，比较k值得最优条件组合为A2B3C2D2，即乙醇体积分数85%、碱化pH8、料液比1:18(g/mL)、提取温度85℃。由表3的方差分析结果可知，在各因素水平范围内，乙醇体积分数对槟榔碱得率影响极显著。

2.3 验证实验

由于优选的工艺未包括在正交设计表的试验中，故对其进行验证实验。准确称取槟榔粉末5.00g，按最佳工艺条件A2B3C2D2进行3次平行实验，分别测定槟榔碱得率，计算得槟榔碱的平均得率为(0.251±0.03)%，高于正交试验中各试验的含量，说明最佳工艺合理。

3 结论与讨论

在单因素的基础上，通过正交试验优选出了乙醇回流提取槟榔碱的最佳工艺条件为乙醇体积分数85%、料液比1:14(g/mL)、提取温度85℃、碱化pH8。在此工艺条件下，槟榔碱的得率可达(0.251±0.03)%。

用氢溴酸调pH值时，由于氢溴酸的氧化性，pH值不宜调太低，一般调至3.0，可使槟榔碱尽可能地完全转化成氢溴酸槟榔碱。此外，在槟榔碱的提纯过程中，反复的提取分离会造成槟榔碱的损失，因此，提取工艺还有待进一步改进。

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Optimizing the Ethanol Reflux Extraction of Arecoline from Betel Nut Husk

LUO Shi-shu，ZHANG Hai-de*，ZHU Li，LIU Xiao-ling
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

The extraction of arecoline from betel nut husk was performed using ethanol refluxing. Arecoline content in the extract was determined by HPLC as the evaluation indicator. The optimal extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration, 85%; material/liquid ratio, 1:14 (g/mL); extraction temperature, 85 ℃; and pH 8. The extraction rate of arecoline was (0.251 ± 0.03)% under these conditions.

betel nut；arecoline；ethanol reflux extraction

TS201.1

A

1002-6630(2010)20-0106-05

2010-06-08

“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAD76B03)；海南大学科研基金项目(Rndy200501；hd09xm83)

罗士数(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为热带果蔬深加工。E-mail：luoshishu@126.com

*通信作者：张海德(1970—)，男，教授，博士，研究方向为热带农产品加工。E-mail：zhanghaide@163.com