丙型肝炎的免疫学研究进展

王东生 姜艳芳 牛俊奇 (吉林大学第一临床医学院肝胆胰内科,长春 130021)

丙型肝炎是一种由丙肝病毒引起的肝脏急慢性炎症,目前世界上约有2亿人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)[1],中国约有3 700万～4 000万[2]。感染者约80%发展成慢性肝炎,在慢性丙肝感染中,HCV不仅导致所感染的肝细胞凋亡,也会干扰肝脏免疫细胞的正常功能,从而免于被免疫系统所清除,同时会导致肝脏免疫病理变化,产生纤维化,最终导致肝癌[3]。HCV感染后大约10%～15%的感染者在感染后能通过病毒特异性免疫应答清除病毒而呈自限性过程。超过80%的HCV感染者不能清除HCV而形成慢性感染,约20%进而发展成为肝硬化、终末期肝病、肝癌等。研究表明,在急性感染的6个月内,迅速而有效的MHCⅠ限制性CD8+应答,协同MHCⅡCD4+T细胞应答可有效的清除HCV,防止慢性丙肝的发生。一般认为,宿主的细胞免疫应答能力强弱对控制HCV感染的慢性化具有重要的作用。

1 丙肝病毒的基因组结构及编码蛋白的特点

HCV是一种球形带脂蛋白包膜的病毒,为单股正链RNA,基因组全长约9.4 kD,基因组两侧为别为5′和3′非编码区,中间为开放性读码框(ORF)[4],编码一条含有3 008～3 037个氨基酸的病毒前体多肽蛋白,编码区从5′端依次为核心蛋白区(C区),包膜蛋白区(E1,E2/NS1),非结构蛋白区(NS2,NS3,NS4A,NS5A和NS5B)[5],C区编码的核心蛋白与核酸结合组合成核衣壳。E1,E2/NS1区编码的包膜蛋白为病毒外壳主要成分,可能含有与肝细胞结合的表位,推测其可刺激机体产生保护性抗体。E蛋白的高度变异可导致病毒不断逃避宿主的免疫应答。病毒的包膜蛋白对于宿主产生体液免疫应答很重要,因为病毒首先接触的是包膜蛋白,宿主的保护性免疫常依赖于针对病毒表面蛋白的抗体,该抗体能阻断病毒与敏感细胞的结合,并通过加强细胞免疫清除病毒。NS3区基因区编码螺旋酶和蛋白酶,NS3蛋白具有强免疫原性,可刺激机体产生抗体[6]。NS5区编码RNA依赖的RNA多聚酶,在病毒复制中起着重要作用。

2 丙肝病毒免疫学特征研究

HCV感染人体后,机体对病毒的结构蛋白和非结构蛋白产生广泛的抗体应答,但是这种抗体不能有效地清除HCV感染。通过对黑猩猩的研究显示,HCV的体液免疫应答具有高度的病毒株变异性,由于HCV的高频率的变异率,对HCV抗体发生耐受的变异株可逃避机体的体液免疫应答而维持HCV的感染[7]。进一步的研究显示,HCV的免疫应答主要和细胞免疫相关,其中最主要的是T细胞,包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。

2.1 CD4+T细胞的研究HCV的特异性CD4+T应答是保护宿主的重要部分。当HCV感染机体后,病毒抗原多肽和Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC)与CD4+T细胞的受体相结合,将激活 CD4+T细胞。CD4+T细胞对重组病毒蛋白的应答表现为细胞大量增殖和/或分泌细胞因子,清除病毒。Deipolder等[8]通过比较HCV一过性与持续性感染者外周血T细胞应答的研究,首次提出了CD4+T细胞参与清除病毒的免疫应答的可能性。Julian Schulze等[9]人在对31个急性丙型肝炎患者的研究中发现,CD4+T细胞与急性丙型肝炎感染的自发性清除密切相关。而进展成慢性丙型肝炎的患者CD4+T细胞应答常表现为缓慢、低下、而且短暂。当机体缺乏CD4+T细胞应答时,HCV特异性的CTL记忆功能不能维持,导致病毒不能有效地清除。但有研究显示,慢性丙肝患者体内有效的HCV核心蛋白特异的CD4+T细胞应答与肝脏损伤及疾病活动性的有效控制密切相关。因此,HCV特异性CD4+应答可能参与控制HCV感染,防止肝脏损伤[10]。

2.1.1 调节性T细胞 越来越多的证据显示调节性T细胞在慢性丙型肝炎的进展中起到重要的作用,尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg,通过对HCV特有的CD8 T细胞的抑制作用,导致疾病的慢性化。近期的研究发现,除了Foxp3的标志外,尚可直接检测CD127,它的优点是不需破膜而可以直接通过流式检测。CD127是IL-7Rα链受体的一部分,在T细胞前体、B细胞前体、成熟T细胞、成熟单核细胞其他一些淋系和髓系细胞上表达。研究发现IL-7R在淋巴细胞的增殖、分化和成熟中起重要作用,体内实验发现T细胞活化后CD127蛋白下调表达,并且CD127低表达与CD25高-中表达具有良好的相关性[11]。在急性丙型肝炎自愈的过程中,调节性T细胞CD4+CD127-逐渐减少,而CD4+CD127+逐渐增多。但是慢性丙型肝炎患者体内的CD4+T细胞的水平却不相同,在感染的24周后,慢性丙型肝炎患者体内的CD4+T细胞几乎不能被发现,在55%慢性丙型肝炎的患者体内找不到CD127。在早期治疗的丙型肝炎患者体内,CD4+T细胞可以被保留下来,在治疗成功的时候主要表现为CD4+CD127+。

2.1.2 Th1/Th2细胞研究 CD4+Th细胞是机体重要的免疫调节细胞,根据其产生细胞因子的不同分为Th1和Th2亚型,分别参与调节细胞免疫和体液免疫。Th1和Th2可相互调节,影响免疫应答的格局。Th1细胞分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-β、TNF-α,主要参与细胞介导的免疫应答,如促进巨噬细胞的活化和细胞毒T细胞的杀伤作用,有利于细胞内病毒及细菌的清除。另外,Th1细胞分泌的IFN-γ可抑制Th2细胞的分化和功能。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13,主要功能为促进B细胞发育和介导体液免疫应答,如促进抗体的产生,抑制细胞介导的免疫应答,抑制单核细胞-巨噬细胞的激活等,主要调节体液免疫。另外,Th2细胞分泌的IL-4、IL-10可抑制Th1细胞的分化和功能[12-14]。Th1亚类细胞促进细胞免疫,对细胞毒T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的功能有辅助作用;Th1类细胞有利于病毒的清除而Th2类细胞主要与组织损伤及慢性化有关[15]。Th1/Th2细胞的调节对维持机体正常的免疫功能至关重要。Th1免疫应答增强宿主对微生物感染,尤其是对病毒和细胞内病原体感染的免疫性和防御功能;而Th2应答则与感染的进展,持续性和慢性化有关,对微生物感染的免疫起到负性调节的作用。Gramenzi[16]等研究了30名慢性HCV感染者外周血中 IL-2、4、10,IFN-γ水平,提示慢性HCV 感染者外周血中Th1免疫应答常可伴随较好的临床后果,而Th2免疫应答常引起慢性持续性肝损伤。

2.2 CD8+T细胞的研究 对HCV急性感染黑猩猩的前瞻性研究发现,CD8+T对丙型肝炎的控制起直接作用,HCV感染早期肝内多种特异性CD8+CTL应答与病毒清除有关。CTLs够直接识别那些位于被感染细胞表面与MHCⅠ分子结合的病毒抗原肽,通过攻击靶细胞而清除病毒。它们释放穿孔素和颗粒酶作用于病毒感染细胞,颗粒酶与穿孔素的协同作用促进病毒感染细胞的死亡。被激活的CTLs逐渐表达 Fas配体(FasL)和 α-TNF,与靶细胞表面的Fas相互识别,从而通过FasL/Fas和TNF-α介导的凋亡途径破坏靶细胞。在急性HCV感染患者体内存在大量HCV特异性CD8+T细胞,多表现为记忆细胞表型CD28(+)CD45RA(-),比恢复期的高3到5倍[17]。Shoukry NH等[18]通过分析比较以往感染HCV并恢复的猩猩,当再次被HCV感染时,他们能够迅速获得病毒特异性的CTL反应,以及CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖,很快控制感染。慢性感染过程中,CD8+T细胞主要识别HCV核心抗原,其分泌IFN-γ的能力显著低于自限性感染。通过一种特异性T细胞受体(TCR),CD8+T细胞能识别HCV感染细胞表面Ⅰ类MHC分子递呈的病毒多肽。抗原多肽-MHC复合物激活的CD8+T细胞可通过溶胞和非溶胞作用控制甚至清除病毒[19]。

3 对HCV病毒免疫应答的其它影响因素

3.1 年龄 多项研究证明,年龄的老化与免疫应答的损伤相关。通过检测外周血淋巴细胞端粒长度来客观的评价免疫衰退的方法,Matthew Hoare等[20]在141例HCV定量阳性病人抗病毒的研究中发现,随着慢丙肝病人年龄的老化,预示着其进展为纤维化,以及进展为肝衰竭、肝癌的进程在加速,甚至对抗病毒治疗的反应也在减弱,且CD8+、CD4+T淋巴细胞端粒的长度在缩短。

3.2 病毒基因型及准种 由于HCV的高度变异性,基因序列之间存在差异,将不同分离株病毒全基因或有代表性的基因片段核苷酸序列相差25%以上者,划分为不同的基因型。而在每个基因型内的分离株,分析核苷酸序列的相似性,如果相似性达到77%～80%,则属于不同的亚型[21]。HCV的这种特性被称为准种(quasispecies),其原因可能为:①RNA依赖的RNA聚合酶缺乏3′-5′核酸外切酶活性,在复制中产生的错误未能纠正[22,23];②宿主免疫选择作用,使能激发宿主细胞或体液反应的基因区域的变异高于其他部位,这种机制也称正性选择作用[24];③病毒的基因结构的限制,病毒的基因结构不同,功能各异,有的区域要求高度保守,否则就产生缺陷性病毒或影响病毒复制及活性,这种机制也称病毒的负性选择作用。Simmonds等根据基因序列的差异可将HCV分为6型和11个亚型。HCV基因型分布具有明显的地域性,其中1型呈全球性分布,占所有HCV感染的70%以上,1b和2a基因型在我国常见,其中以1b型为主[25]。即使是同一个基因型感染,在体内常可检测到区域的多种变异,进而诱发机体的免疫耐受,导致感染的慢性化。

3.3 治疗因素 抗病毒治疗在病毒感染的转归中起到重要的作用,有效地抗病毒治疗可促进病毒的清除,而无效的抗病毒治疗可导致病毒发生变异,产生药物耐受。常用的抗病毒药物为干扰素及利巴韦林联合治疗。干扰素可刺激HCV特异性CD4+T细胞及CD8+的T细胞免疫应答。利巴韦林是一种合成的嘌呤核苷类似物,具有广谱DNA及RNA病毒活力。在慢性丙肝患者中,利巴韦林可增强Th1活性,抑制Th2活性[26]。因此,利巴韦林可通过免疫调节功能增强干扰素的抗HCV活性。

3.4 宿主因素 病毒的直接致病作用以及宿主的免疫机制被激活继而破坏感染的肝细胞是HCV参与致病的过程2种主要机制。尽管病毒本身因素(如病毒变异、基因型)在此过程中起着重要作用,但有研究发现,即使是相同的病毒株感染不同宿主时,其临床表现也有很大差异。因此,与遗传相关的免疫因素可能在丙型肝炎的发病过程中起着重要作用。近期的研究表明,在1型丙型肝炎人群中,19号染色体附近的基因的多态性与治疗效果有明确的相关性,此变化位于IL28B基因上游约3000个碱基对的位置上,可以有CC、TT、CT等不同的变化。通过对1 671人研究中发现,CC型的病人对治疗的反应明显高于CT及TT型病人。且自愈的患者中多数为CC型病人。充分说明宿主的遗传在丙肝的发展中起到重要的作用[27]。

4 总结

HCV为一种RNA病毒,其感染人体后可诱发固有免疫应答以及适应性免疫应答。固有免疫应答包括IFN、NK细胞以及巨噬细胞。人体抗病毒的主要机制为病毒特异性的获得性免疫应答,包括体液免疫及细胞免疫。体液免疫应答由B淋巴细胞表达的抗原识别受体识别病毒的抗原决定簇,而产生病毒特异的抗体。但丙型肝炎的抗体无保护作用,其病毒清除主要依靠细胞免疫应答。细胞免疫应答由T细胞所介导,主要清除病毒感染细胞,同时诱发肝脏损伤。其中CD4+T、CD8+T、调节性T细胞起到重要作用。接近80%的HCV急性感染者会转成慢性感染性疾病。急性感染康复病人通常免疫系统皆具有强烈的由细胞毒T细胞和辅助性T细胞主导的病毒特异反应能力,而慢性感染病人缺乏有效的针对HCV特异的CD4+T细胞介导的免疫应答。HCV成功地通过一系列连续步骤,干扰人体天然免疫及获得性免疫系统的抗病毒能力,一方面,HCV通过多种策略,包括干扰免疫细胞信号传导系统,促进效应细胞功能失调及自身持续遗传变异相结合的手段来逃逸宿主免疫系统的攻击。另一方面,宿主的天然及获得性免疫系统也对HCV的感染主动产生免疫应答(应答的能力减弱),调节性T细胞在病毒清除过程中发挥关键性的作用。这些策略的成功实施最终导致HCV在宿主体内成功扩增繁殖及持续感染。故研究HCV感染的免疫学机制对于有效的清除病毒预防免疫应答造成的肝脏损伤具有重要的作用。

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