构建携带幽门螺杆菌oipA核酸的减毒沙门重组菌株及其免疫保护作用的初步研究①

林妙端 陈建森 佘菲菲 陈 豪

(福建医科大学病原生物学系福建省感染与肿瘤重点实验室,福州350004)

幽门螺杆菌(Hp)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因,并与胃腺癌和胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关[1]。全世界约有50%的人患有 Hp相关性胃肠疾病,联合应用质子泵抑制剂和抗生素的三联疗法是目前控制 Hp感染的主要方案,但存在细菌耐药,抗生素治疗后细菌的球形变异、药物不良反应及药效经济学等问题[2]。因此,研制 Hp疫苗是预防和治疗Hp感染切实有效的方法。近年有关核酸疫苗的研究倍受关注。核酸疫苗作为一种新型疫苗,能使机体对质粒所编码抗原产生强烈而持久的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有安全,高效,成本相对较低,性质比较稳定等优点[3]。

oipA(outer inflammatory protein)基因编码前炎症外膜蛋白,相对分子质量为34 kD,是一种较强的Hp致病基因,特别在 Hp感染的炎症过程中起着重要的作用。许多研究表明,OipA与活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌有明显的相关性[4,5]。我们以往的研究结果表明oipA DNA重组质粒,经肌注途径免疫,具有抗 Hp的免疫保护作用,但是保护率较低,仅50%[6]。本研究对oipA基因序列进行密码子优化,K ozak前导序列添加、CpG序列优化,拟构建携带oipA优化基因真核表达载体的SL7207重组菌株,并研究其对C57BL/6小鼠抗 Hp感染的免疫保护作用,以获得高效的口服疫苗。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞株及质粒 幽门螺杆菌国际标准株J99及SS1株购自中国疾病预防控制中心传染病研究所;大肠杆菌DH5α(Invitrogen公司);鼠伤寒沙门菌LB5000和aroA基因缺陷的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207由本实验室保存;胃腺癌细胞系(AGS)购自中科院上海细胞库;真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)。

1.2 实验动物 C57BL/6小鼠60只,6周龄,雌性,体重(18±2)克,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物质量合格证号为0056435,福建医科大学动物实验室SPF级小鼠饲养室饲养,许可证号为SYXK(闽)2008-0001,适应性饲养1周后用于免疫实验。

1.3 pVAX1-oipA重组子的构建 从 GenBank数据库中获取 HpJ99 oipA全长基因序列(基因号：NC 000921),应用DNAMAN分析基因和pVAX1的酶切图谱,应用Oligo 6软件设计引物序列,在上游引物的的5′端引入 PstⅠ酶切位点,下游引物的3′端引入XhoⅠ酶切位点,引物由上海博尚生物技术有限公司合成 ,序列如下 ：oipA-F：5′-AAAACTGCAGATG AAAAAAGTCCTCTTACTAAC-3′;oipA-R ：5′-CCGCTCG AGTTAATGTTTGTTTTTTAAAGTTA-3′。以 提 取 的J99基因组为模板,用上述合成的引物进行PCR扩增。反应条件：94℃2分钟;(94℃30秒,54℃45秒,72℃90秒)×30;72℃7分钟。取25μl PCR产物(924 bp)电泳回收后,用PstⅠ和XhoⅠ对目的基因和载体pVAX1进行双酶切,将目的基因和经过CIP处理过的载体pVAX1连接后转化入DH5α感受态细胞中,在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB选择培养基上培养,随机挑取单克隆菌落过夜培养,小量提取质粒进行PCR,酶切鉴定,并将初步鉴定含阳性重组子的细菌克隆送上海博尚生物技术有限公司进行序列测定。

1.4 oipA基因序列的优化和pVAX1-optioipA重组子的构建 在保持oipA基因全部氨基酸不变的原则下,由上海生工生物工程技术服务有限公司应用软件将其密码子改为小鼠偏爱的密码子,进行 CpG序列优化,并在基因的上游引入PstⅠ酶切位点以及K ozak序列,下游引入XhoⅠ酶切位点,最后将合成的oipA优化基因(942 bp)重组入真核表达载体pVAX1,命名为pVAX1-optioipA。

1.5 重组子瞬时转染AGS细胞 将含重组子和空质粒的菌体大规模培养,用Qiagen Plasmid Midi K it提取pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA,pVAX1,调整浓度为1 mg/ml。应用含10%胎牛血清(FBS)的F12培养基(Sigma公司),37℃、5%CO2常规培养AGS细胞,至对数生长期以0.25%的胰蛋白酶消化细胞,计数并转种入6孔板,5×105/孔,培养约24小时至细胞密度为90%～95%。更换不含FBS的培养基,分别取4μg质粒按比例与LipofectamineTM2000(In-vitrogen公司)和不含 FBS的培养基混合,室温孵育20分钟后均匀加入AGS细胞培养孔中,5小时后更换完全培养基继续培养48小时,弃去上清液,细胞以RIPA裂解液(碧云天公司)裂解,裂解细胞溶液放置-80℃冰箱保存备用。

1.6 Western印迹法检测表达蛋白免疫原性 BCA法测定三组蛋白浓度后,取裂解细胞溶液加入1×SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10分钟后,以相同蛋白量上样,采用12%SDS-PAGE进行电泳,转移至硝酸纤维素膜(NC膜),3%牛血清白蛋白(BSA)封闭4小时,加入兔抗oipA抗体(Abmart公司为本室制备)4℃孵育过夜,洗涤3次后加AP标记的羊抗兔 IgG(北京中杉金桥生物公司)室温孵育2小时,洗涤3次后涂CDP-Star,曝光,显影,扫描。

1.7 重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗构建和稳定性检测 挑取减毒鼠伤寒沙门菌SL7207单个菌落于LB培养液中振荡(200 r/min)培养过夜,按1∶100接种500μl菌液于50 ml LB培养液中继续培养至OD值至0.6～0.7,用灭菌双蒸水洗涤1次后再用10%灭菌甘油洗涤2次(4℃,4 000 r/min,10分钟),最后加入2 ml 10%灭菌甘油重悬菌制成SL7207感受态细胞,分装后放置-80℃冰箱保存备用。通过氯化钙法将重组子pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,和空质粒pVAX1转入鼠伤寒沙门菌LB5000,提取经过甲基化修饰的pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,pVAX1分别加入80μl SL7207感受态细胞,冰浴5分钟后转移至电击杯(1 mm)中 ,电转化条件：2 000 V电压,25μF电容,200Ω电阻,放电时间4～5秒。电击后将转化液加入1 ml LB培养中静置培养2小时,吸取100μl培养液接种于LB平板(50μg/ml卡那霉素)中37℃培养过夜,挑取阳性克隆抽提质粒进行鉴定,培养制备成疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,和空质粒菌SL7207/pVAX1,用灭菌的PBS调成2.5×109CFU/ml备用。将构建好的SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培养液中分别培养传代50次,每10代提取一次质粒,酶切鉴定。

1.8 重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的免疫保护作用

1.8.1 口服免疫小鼠 小鼠随机分成5组：①PBS组(10只);②SL7207组(10只);③SL7207/pVAX1组(10只);④SL7207/pVAX1-oipA疫苗组(15只);⑤SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组(15只)。小鼠禁食一夜,禁水4小时,先以无菌3%NaHCO3100μl灌胃以中和胃酸,30分钟后再予 200μl菌液(5×108CFU/只)灌胃,PBS对照组予200μl PBS,2小时后恢复饮食、饮水。2周后加强免疫一次。

1.8.2 间接ELISA法测小鼠血清中抗 HpoipA特异性抗体 末次免疫2周后从小鼠眼内眦采血制备血清。以终浓度为5μg/ml的oipA抗体(Abmart公司为本室合成)包被96孔酶标板,100μl/孔,4℃过夜,PBS(含3%BSA)37℃封闭2小时,以含 0.05%Tween 20的PBS缓冲液(PBST)洗涤后加待测血清(1∶100),每份标本均测3个复孔,37℃孵育2小时,洗涤后加HRP标记羊抗鼠IgG(美国Santa Cruz公司1∶500),37°C孵育2小时,洗涤后于各反应孔中加入临时配制TMB底物反应液,室温放置30分钟显色,加入反应终止液(2 mmol/L H2SO4),于OD490nm波长测定各反应孔OD值,以oipA抗体为阳性对照,3%BSA/PBST孔做阴性对照调零。血清抗 HpoipA IgG抗体浓度以OD490表示。

1.8.3 Hp攻击免疫小鼠后胃组织细菌学检测 末次免疫4周后,以 HpSS1株菌液(5×108CFU/只)灌胃攻击,隔天1次,共3次。末次攻击4周后,禁食24小时,处死小鼠,无菌取胃,沿胃大弯剪开,用生理盐水漂洗后,取一小块胃粘膜行快速尿素酶试验,另取胃组织采用半定量细菌培养法,胃组织称重后,制成匀浆 ,用布氏肉汤 1∶10、1∶100、1∶1 000 倍比稀释后,各取100μl涂于布氏血琼脂平板上,37℃微需氧条件下(5%O2、10%CO2、85%N2)培养 3～5 天 ,细菌作快速尿素酶(三强生物化工有限公司)试验,涂片革兰氏染色镜检及PCR鉴定(用上述oipA引物)。鉴定正确后进行菌落计数,计算单位胃组织的定植细菌密度。

1.9 统计学处理 各组间率的比较用SPSS13.0 for Windows统计软件进行Fisher精确检验,计量资料以±s表示,各组之间进行One Way Anova检验,以P＜0.05和P＜0.01提示差异显著和极显著。

2 结果

2.1 真核表达载体的构建及鉴定 以 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA为模板利用上述引物PCR扩增出大约为1 kb的片段(图1);应用 PstⅠ/Xho Ⅰ分别酶切pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,经 1%琼脂糖凝胶电泳显示双酶切后,可见释放目标片段,目标片段约1 kb(图2);pVAX1-oipA序列测定(上海博尚生物技术有限公司)结果显示其核酸序列与 GenBank数据库公布的 HpJ99 oipA全长基因序列完全一致,pVAX1-optioipA序列测定(上海生工生物工程技术服务有限公司)与本研究原先设计的核酸序列完全一致,证明已成功构建了pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA重组子。

2.2 目的基因在AGS细胞中表达的检测 Western印迹法结果显示：在 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA、pVAX1瞬时转染AGS细胞48小时后,细胞裂解液能检测到OipA蛋白(34 kD)的表达。而空载体pVAX1未见目的蛋白条带。与pVAX1-oipA相比,pVAX1-optioipA蛋白表达量较高(图3),这证明经过密码子优化,K ozak前导序列添加等优化措施可以提高OipA蛋白在真核细胞中的表达量。

图1 重组质粒pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA PCR鉴定Fig.1 Identification of pVAX1-oipA、pVAX1-optioip A recombinant plasmid by PCR

图2 重组质粒pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA的酶切鉴定Fig.2 Identification of pVAX1-oipA,pVAX1-optioip A recombinant plasmid by digestion with restriction enzymes PstⅠand XhoⅠ

图3 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA表达OipA蛋白的 Western印迹图Fig.3 Western blot analysis of OipA protein expressed by pVAX1-oipA,pVAX1-optiopA

图4 重组减毒鼠伤寒沙门菌核酶疫苗的酶切鉴定Fig.4 Identification of Attenuated Salmonella typhimurium containing recombinant plasmid by digestion with restriction enzymes PstⅠand XhoⅠ

2.3 重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗构建和鉴定重组疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA、SL7207/pVAX1-

optioipA和空质粒菌SL7207/pVAX1抽提质粒,经电泳后均获得相应的电泳条带,重组疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA抽提质粒经PstⅠ/XhoⅠ酶切后获得一条约1 kb的电泳条带,其大小与oipA全长序列相符(图4),重组疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA血清凝集试验结果均为A-F多价、O4菌体和H1鞭毛抗原阳性。证明成功构建携带Hp oipA基因和oipA优化后基因真核表达载体的SL7207重组菌株。将构建好的SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培养液中分别培养传代50次,每10代提取一次质粒,酶切鉴定结果都能获得一条约1 kb的电泳条带,其大小与oipA全长序列相符,证明在没有抗生素选择压力下重组减毒沙门氏菌能保持其稳定性。

表1 小鼠血清抗 HpoipA特异性抗体ELISA检测结果Tab.1 The result of ELISA detected the mice serum anti-Hp oipA antibodies

表2 小鼠胃组织细菌学检测结果Tab.2 The result of bacteriology test of gastric mucosa

2.4 间接ELISA法测小鼠血清中抗 HpoipA特异性抗体结果 口服免疫2周后,小鼠血清抗 HpoipA特异性抗体 ELISA检测结果见表1,疫苗接种组(SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA)小鼠血清中抗oipA抗体的OD值显著高于对照组(P＜0.01),表明了oipA在体内表达了相应的蛋白,该蛋白具有刺激机体产生免疫应答的免疫原性。其中SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组小鼠血清中抗oipA抗体的OD值显著高于SL7207/pVAX1-oipA疫苗组(P＜0.01),推测经过优化的oipA基因其蛋白在小鼠体内得到较高水平的表达。

2.5 免疫保护实验结果 Hp感染的科研诊断标准是:Hp培阳性或Hp形态学、尿素酶依赖试验、血清学试验、特异性PCR,4项中任2项阳性,即可判定为 Hp感染阳性。本实验采用小鼠胃粘膜组织快速尿素酶试验及细菌定量培养来检测 Hp感染状况,结果见表 2。疫苗接种组(SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA)的Hp感染率显著低于对照组(P＜0.01)。其中SL7207/pVAX1-oipA疫苗组的Hp感染率为60%,SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组的Hp感染率为26.67%,对感染阳性的小鼠,我们进行了 Hp定植密度的分析,发现3组对照组 Hp的定植密度都在105CFU/g以上,明显高于疫苗接种组(P＜0.01),其中 SL7207/pVAX1-oipA疫苗组 Hp定植密度高于 SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组(P＜0.01),表明oipA核酸疫苗对 Hp感染小鼠具有一定的免疫保护作用,优化oipA基因有助于提高免疫保护的效果。

3 讨论

核酸疫苗是继减毒、灭活和亚单位疫苗之后的第3代疫苗,被誉为预防医学领域的第3次疫苗革命。与以往的减毒、灭活等蛋白疫苗相比,核酸疫苗虽然具有无法比拟的优点,但仍需优化。针对目前的技术水平来说,没有修饰的裸露DNA质粒,转染细胞后蛋白的表达不够理想,诱导的免疫反应较弱,因此为了得到更理想的免疫效果,进行核酸疫苗的优化是十分必要的[3]。

核酸疫苗主要由保护性抗原及真核表达载体构成,保护性抗原的筛选是构建核酸疫苗的关键,我们实验室以往的研究结果表明编码OipA蛋白的核酸疫苗肌注BALB/c小鼠具有抗 Hp的免疫保护作用,但是保护效率比较低[6]。究其原因,可能与机体细胞吸收核酸疫苗的效率很低,抗原表达量少,难以达到足够的免疫刺激剂量有关。对于疫苗而言,抗原蛋白的表达水平对其免疫原性起着十分关键的作用[7]。而提高核酸疫苗在机体中抗原的表达,其中重要的环节之一是通过抗原密码子优化。细菌、植物、动物各有自己偏好的密码子,对已知氨基酸序列的抗原来说,可以通过优化密码子,使用宿主偏好的密码子,从而提高抗原在宿主中的表达水平。有相当多的文献报道,抗原基因密码子的优化可以显著的改善蛋白的表达效率[8,9]。另一环节可以通过K ozak前导序列添加来提高抗原表达量。K ozak序列是 K ozak M发现的,他详细研究了起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响,并总结出在真核生物中,起始密码子周边序列为CCACCATGG时转录和翻译效率最高,该序列被广泛应用于真核表达载体的构建中。谢庆军等[10]在人p53肿瘤抑制基因编码区前设计了一个K ozak序列,从而在蛋白翻译水平提高基因的表达量。

近年来研究证实减毒鼠伤寒沙门菌是良好的重组质粒承载系统,作为疫苗载体接种安全无毒,效果优于直接接种抗原蛋白或重组质粒,且无需其他粘膜免疫佐剂(佐剂均有一定不良反应),具有广阔的应用前景[11]。随着对沙门菌毒力遗传以及重组DNA技术的深入了解,已经研制出许多遗传确定的新型弱毒伤寒株作为口服活疫苗的候选菌株,其中研究最广泛的是营养缺陷型弱毒株如aro基因缺失株,cya/crp基因缺失株,Dam和phoP/phoQ基因缺失株等[12]。本研究采用aroA基因缺陷的减毒鼠沙门菌SL7207为载体,aroA编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶,该酶催化2,4-二羟基苯甲酸盐的分支酸途径的中间反应,产生芳香族氨基酸。而哺乳动物不具备该合成途径,故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小,使得aroA突变株在体外培养时依赖上述化合物生长,但在宿主体内只能有限生长繁殖从而得到减毒。国内外学者广泛选用减毒鼠沙门菌SL7207作为核酸疫苗的载体菌[13-15]。

为了提高oipA核酸疫苗抗 Hp的免疫保护作用,研制高效的 Hp疫苗,本研究对oipA基因进行了一系列优化,包括添加了 GCCACC前导序列,选择小鼠偏爱的密码子,并合理调整CG的含量达到CpG序列优化,以期通过提高抗原在宿主中的表达水平,同时发挥CpG免疫佐剂的作用,提高宿主对oipA核酸疫苗的免疫应答进而提高oipA核酸疫苗抗 Hp的免疫保护作用。本实验将oipA基因和oipA优化基因克隆入 pVAX1真核表达载体,获得重组子pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA。因为人类、啮齿类以及猪这3种哺乳动物对绝大多数密码子的偏嗜性是相同或相似[16],所以采用人胃腺癌AGS细胞对重组子的表达进行体外检测。将上述重组子与空载体pVAX1一起瞬时转染人胃腺癌AGS细胞,应用Western blot检测转染细胞中优化前后OipA蛋白的表达,研究发现pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA均可在AGS细胞中表达,且pVAX1-optioipA蛋白表达量高于pVAX1-oipA。在验证了重组子表达蛋白的基础上,将pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA转入减毒鼠沙门菌SL7207,经过鉴定制成稳定的口服核酸疫苗。最后体内实验表明,优化后的oipA基因在小鼠体内表达的蛋白量高于未优化的oipA基因,小鼠接种疫苗菌后均获得一定的免疫保护,Hp感染率明显低于对照组,而 Hp感染的疫苗组小鼠胃组织中Hp定植密度显著降低,其中优化后oipA核酸疫苗组获得更好的免疫保护效果。

综上所述,本研究成功构建了携带 HpoipA核酸疫苗和优化后oipA核酸疫苗的SL7207重组菌株,体外实验证实其可表达具有免疫原性的抗原蛋白,体内实验证实其对小鼠 Hp感染具有免疫保护性,优化oipA基因可提高核酸疫苗的免疫保护效果,这为对 Hp核酸疫苗作更深入的实验研究及其临床应用奠定了基础。

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